王洋等

摘 要：建立飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）測定方法。試樣用磷酸鹽緩沖溶液提取，經固相萃取小柱凈化，氮氣吹干后用溶解待測。采用LC-MS/MS測定，色譜柱為C8反相色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，電噴霧正離子模式電離，多反應選擇離子檢測（MRM），外標法定量。結果表明方法可用于飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的同時測定。。

關鍵詞：飼料；液相色譜-串聯(lián)質譜；恩諾沙星；環(huán)丙沙星；諾氟沙星；多反應監(jiān)測 【中圖分類號】TS214.2 【文獻標識碼】A

Abstract：To establish a liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for determinations of enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin in Feeds.enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin were extracted by sonication with Phosphat buffer solution.By the SPE cartridge and nitrogen dry，the extracts were dissolved.The separations were performed on a C8 reversephase columnusing acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phase.The analysis was carried out under positive ESI MS/MS and multiple reaction monitoring mode （MRM）.The method was proved to be simpl and accurate.

Key words：Feeds；Liquid chromatography-mass spectrometry；Enrofloxacin，Ciprofloxacin；Norfloxacin；Multiple reaction monitoring

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星屬于喹諾酮類藥物，由于其具有抗菌譜廣、殺菌活性強、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌濃度低等優(yōu)點，被廣泛應用于各種動物感染性疾病的預防和治療。但有一部分生產者將其應用到飼料產品中，起到抑菌殺菌的作用。如果動物食用這種飼料會造成一定的危害，產生耐藥性或一些毒副作用。因此，建立快速準確地測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法，對于加強飼料產品監(jiān)管具有重要意義。

本文建立的液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）快速準確地測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法，可滿足檢測要求，為飼料產品監(jiān)督檢驗提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1200LC/-6410B MS液相色譜/串聯(lián)四極桿質譜儀（安捷倫科技有限公司）；BS224S電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；HYQ-2110液體混勻器（蘇州捷美電子有限公司）；KQ-250DE超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；Microfuge離心機（美國BECKMAN公司）。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星標準品，純度>98%（美國SIGMA公司）；乙腈、甲酸為色譜純（Burdick&Jackson公司）；無水乙醇（分析純，天津市化學試劑有限公司）；樣品購自本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀釋至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流動相液將恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星儲備液液稀釋成10μg/mL的工作液。

1.2.2 樣品處理

稱取試樣0.5g（精確至0.1mg）于50mL具塞離心管中，準確加入6mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻，再加入10mL乙腈，于渦旋振蕩器振蕩提取1min，5000r/min離心5min，上清液過濾到雞心瓶中，在殘渣中加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，10mL乙腈，重復以上步驟，合并上清液，于50℃旋轉蒸發(fā)，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，混勻。

固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸鹽緩沖溶液活化，保持柱體濕潤。將樣液以1mL/min的流速全部過HLB固相萃取小柱，待液體完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液洗脫于10mL具刻度離心管中，洗脫液于50℃，氮吹至約0.2mL時停止?jié)饪s，用甲醇-甲酸溶液定容至1mL，5000r/min離心5min，過0.2μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質譜分析。

1.2.4 儀器參數(shù)和測定條件

液相色譜條件：C8反相色譜柱（C82.1mm×50mm id，5μm）；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；進樣量：5μL；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（15+85）。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；噴霧壓力：35psi；干燥氣流速：8mL/min；離子化溫度：340℃。

2 結果與分析

2.1 樣品提取方法的選擇

喹諾酮類藥物的化學結構中有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，在酸性和堿性溶液中有較好的溶解性。因此嘗試用磷酸鹽緩沖液進行提取，此時待測物以負離子形式存在，過固相萃取小柱后就富集在了小柱上，然后再用酸化甲醇進行洗脫[1-4]。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在一定的流動相條件下，喹諾酮類藥物在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留，選擇實驗室常用的C8柱（50mm×2.1mm）。應用反相色譜條件時，LC-MS/MS分析方法應用的有機相主要為甲醇和乙腈，喹諾酮類藥物在甲醇中的信號要比在乙腈中高，選用乙腈作為有機相時，待分析組分的色譜行為較好。實驗發(fā)現(xiàn)甲酸的加入會抑制其信號，甲酸體積分數(shù)越高抑制信號越嚴重，但考慮到能夠改善峰形，使待測物與內源性物質充分分離，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相（見圖1）。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

對質譜條件進行優(yōu)化，盡可能的使待測物響應信號達到最高。在優(yōu)化過程中比較恩諾沙星在正、負兩種離子化方式的響應值，發(fā)現(xiàn)正離子化效率遠遠高于負離子，正離子響應值高，因此選擇了正離子掃描方式。采用Product掃描的方式選擇特征離子，逐步加大誘導碰撞能量，隨著母離子的豐度逐漸減少，子離子的豐度逐漸增加，分別選用豐度最大的兩個子離子作為定量和輔助定性離子，并確定其最佳碰撞能量值，在Product方式中進一步調整碰撞能量，以便獲得最大靈敏度（見表1，圖2-4）。

2.4 線性與檢出限

取陰性樣品，依次加入適量待測物質標準系列溶液，在液相色譜-串聯(lián)質譜設定條件下分別進樣，以標準與內標物峰面積比值為縱坐標，工作溶液濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星檢出限為10μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

根據GB/T 5009.1-2003，我們選取1種空白飼料樣品，分別加入50μg/kg水平的三種喹諾酮藥物，按照樣品處理方法及相同的色譜條件下，進行回收率的測定，每個樣品重復3次，計算出每個添加水平的回收率（結果見表2）。

3 結論

本文建立了飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用測定方法，該法具有樣品處理簡單、測定周期短等優(yōu)點，適用于大量樣品的快速篩選、測定。

參考文獻

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