羅霆等

摘 要 利用4個(gè)不同細(xì)胞質(zhì)源的甘蔗親本配成正反交組合，在對(duì)雜種后代進(jìn)行SSR-PCR真?zhèn)舞b別的基礎(chǔ)上，對(duì)不同組合后代的不同性狀進(jìn)行t檢驗(yàn)和差異性比較。結(jié)果表明：這7對(duì)正反交組合后代的株高、莖徑和有效莖數(shù)均差異不顯著，僅有一對(duì)父母本細(xì)胞質(zhì)源相同的正反交組合后代葉綠素含量差異較大；當(dāng)以細(xì)胞質(zhì)源為Bandjarmasim Hitam的不同親本作母本時(shí)，子代黑穗病發(fā)病率較低，為18.8%和18.9%；當(dāng)以細(xì)胞質(zhì)源為Badila的崖城58-47作母本時(shí)，子代黑穗病發(fā)病率較高，為28.8%和28.4%。以細(xì)胞質(zhì)源為Black Cheribon的不同親本作母本時(shí)，其后代真雜種率在91.7%～98.8%之間，而以細(xì)胞質(zhì)源為Bandjarmasim Hitam和Kaludia Boothan作母本時(shí)，得到真雜種率低于70%的后代群體。說明雖然甘蔗主要農(nóng)藝性狀的細(xì)胞核遺傳占主導(dǎo)地位，但是不同細(xì)胞質(zhì)源仍在花粉育性和抗病性等方面發(fā)揮作用。本文研究了不同細(xì)胞質(zhì)源的甘蔗親本與甘蔗主要性狀遺傳表現(xiàn)的相關(guān)性，為甘蔗育種利用優(yōu)異細(xì)胞質(zhì)源以及進(jìn)一步從分子水平上研究和發(fā)掘甘蔗優(yōu)異細(xì)胞質(zhì)基因奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甘蔗；細(xì)胞質(zhì)源；正反交；黑穗??；農(nóng)藝性狀

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Sugarcane varieties with four different cytoplasmic sources were used to combine reciprocal crosses. The characters of various hybrid progenies were analyzed by t test and variance analysis after distinguishing true and false of the hybrid progenies with SSR-PCR. The results showed that， there were not significant difference in height， diameter and number of productive tiller among the 7 pairs of progenies of pros and cons combinations， but the concentration of chlorophyll had a significant difference in only one hybrid progenies from that the cytoplasmic sources of parents was the same. As the female parent containing Bandjarmasim Hitam cytoplasmic source was used to cross， the incidence of smut in offsprings were lower with 18.8% and 18.9% respectively， but when the female parent was YC58-47，containing Badila cytoplasmic source， the incidence of smut in offsprings were highter with 28.8% and 28.4% respectively. The true rate of hybrid progeny with 91.7-98.8% as using the female parent containing Black Cheribon cytoplasm source compared that with less than 70% as the female parent containing Bandjarmasim Hitam and Kaludia Boothan cytoplasmic source. The results suggested that although nuclear genetic was the dominant in the major agronomic traits of sugarcane plant， but cytoplasmic source also play a role in pollen fertility and disease resistance， et al.In this study， the relationship between the parents with different cytoplasmic sources and genetic performance of major agronomic traits in sugarcane was discussed， the result should be provide scientific basic for use of sugarcane breeding with excellent source of cytoplasm， and further researching and exploring of excellent cytoplasm gene on molecular level.

Key words Sugarcane； Cytoplasmic source； Reciprocal crosses； Smut； Agronomic characters

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.012

現(xiàn)代甘蔗育種的親本多為熱帶種原種和少數(shù)割手密的后代，少部分含有大莖野生種、中國(guó)種或印度種血緣，并且經(jīng)過甘蔗育種工作者長(zhǎng)期的選擇，使現(xiàn)有基因庫的絕大多數(shù)有益基因通過不斷的重組聚集到現(xiàn)有甘蔗品種中，育種基因庫的遺傳總變異縮小，遺傳背景狹窄。在近百年的甘蔗育種實(shí)踐中，由于只考慮核基因的影響而忽略細(xì)胞質(zhì)基因的作用，使目前全世界范圍內(nèi)的甘蔗品種的細(xì)胞質(zhì)源局限在班扎馬新黑潭（Bandjarmasin Hitam）、黑車?yán)锉荆˙lack Cheribon）、卡路打布廷（Kaludia Boothan）和拔地拉（Badila）這4個(gè)熱帶種原種中[1-3]，一些主要由細(xì)胞質(zhì)基因影響或存在核質(zhì)互作效應(yīng)的性狀改良一直在甘蔗品種改良中被忽視，在此基礎(chǔ)上，甘蔗育種就很難再獲得新的突破，造成現(xiàn)代甘蔗栽培品種雖然具有高產(chǎn)高糖等優(yōu)良特性，但抗病、抗逆等綜合抗性下降的問題也日益突出。如中國(guó)當(dāng)前大面積推廣的ROC22在生產(chǎn)上感黑穗病嚴(yán)重；ROC16抗旱性差以及絕大多數(shù)推廣品種在宿根后易感宿根矮化病等[4-5]。因此，發(fā)掘利用新的基因資源包括細(xì)胞質(zhì)基因?qū)Ω收嵊N意義重大。

細(xì)胞質(zhì)基因是非常重要的基因資源，由于編碼細(xì)胞中相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)分子，對(duì)株高、莖徑、分蘗等外觀農(nóng)藝性狀、育性以及抗性有顯著的影響。Rajcan等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞質(zhì)源的油菜Reston和LL 09作親本正反交，其F1群體的開花期、成熟期、株高和種子的特性有顯著的差異，認(rèn)為油菜的許多農(nóng)藝性狀受細(xì)胞質(zhì)基因控制，母本的選擇對(duì)性狀的表現(xiàn)有很大的影響；Bernet等[7]在蕓香科柑橘C. clementina和柚子C. grandis的正反交試驗(yàn)中證實(shí)，不同母本可使后代果實(shí)的大小、口味及色澤有很大的差異；Moriguchi等[8]利用cpDNA和mtDNA的特異條帶區(qū)分興安落葉松和日本落葉松，證實(shí)利用單母細(xì)胞克隆（SMC）克服了松屬的自交不親和現(xiàn)象，表明細(xì)胞質(zhì)基因與松屬的育性相關(guān)；Wang等[9]研究認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)基因影響馬鈴薯的抗性；Lal等[10]研究5個(gè)不同細(xì)胞質(zhì)源的罌粟親本對(duì)后代的影響，認(rèn)為不同細(xì)胞質(zhì)源親本對(duì)罌粟的莖稈性狀有顯著影響。由以上研究可推斷，細(xì)胞質(zhì)源或細(xì)胞質(zhì)基因?qū)r(nóng)藝性狀、抗性有影響，利用適宜的細(xì)胞質(zhì)基因可改良植物的農(nóng)藝性狀、抗性等有關(guān)性狀。

在甘蔗細(xì)胞質(zhì)相關(guān)研究方面，D'Hont等[11]利用RFLP技術(shù)對(duì)甘蔗屬內(nèi)57個(gè)不同地域來源的栽培品種和野生種質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)基因多樣性進(jìn)行研究，認(rèn)為這些種質(zhì)的mtDNA多態(tài)性豐富，依據(jù)線粒體的聚類分析與野生種質(zhì)根據(jù)表型和同工酶的系統(tǒng)分類一致；唐仕云等[12-13]認(rèn)為母本細(xì)胞質(zhì)源對(duì)正反交后代開花特性、凈光合速率、株高、莖徑、錘度等性狀有顯著影響；盛孝邦[14]總結(jié)中國(guó)甘蔗育種多年的研究資料，得出了在不同的雜交組合中母本的細(xì)胞質(zhì)源在后代中有較強(qiáng)的遺傳效應(yīng)的結(jié)論；美國(guó)農(nóng)業(yè)部荷馬甘蔗研究所Pan等[15-16]從本世紀(jì)初開展了割手密細(xì)胞質(zhì)源利用的研究，其研究小組利用19對(duì)cpSSR引物研究了崖城割手密及其后代共4個(gè)材料的葉綠體基因組，認(rèn)為葉綠體基因的多態(tài)性說明了崖城割手密的進(jìn)化趨異[17]，并成功地于2012年釋放了一個(gè)含割手密細(xì)胞質(zhì)的能源甘蔗新品種Ho02-113[18]；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所近年來利用斑茅和割手密雜交，成功創(chuàng)制斑茅割手密復(fù)合體，獲得了在產(chǎn)量相關(guān)性狀和抗性上表現(xiàn)出較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的具有割手密細(xì)胞質(zhì)源的育種材料[19]。

目前，不同親本細(xì)胞質(zhì)源對(duì)甘蔗雜交后代主要性狀的影響鮮見報(bào)道，本研究擬利用不同細(xì)胞質(zhì)源的甘蔗親本配成正、反雜交組合，分別對(duì)正交和反交后代群體進(jìn)行主要性狀差異分析，研究不同細(xì)胞質(zhì)源的甘蔗親本與甘蔗主要性狀遺傳表現(xiàn)的相關(guān)性，為甘蔗育種利用優(yōu)異細(xì)胞質(zhì)源，以及進(jìn)一步從分子水平上研究和發(fā)掘甘蔗優(yōu)異細(xì)胞質(zhì)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試親本來自中國(guó)農(nóng)科院甘蔗研究中心海南甘蔗雜交基地和廣州甘蔗糖業(yè)研究所海南甘蔗育種場(chǎng)，雜交統(tǒng)一采用人工授粉的方法，父本采用50 ℃溫湯處理10 min的方法去雄，所用花粉量及被授小花數(shù)相當(dāng)。所配組合及親本細(xì)胞質(zhì)源如表1。

1.2 方法

1.2.1 正反交組合F1代雜種真?zhèn)舞b別 將收獲的花穗晾曬干燥后，于2011年2月稱取每穗種子50 g播種育苗，苗高15 cm左右時(shí)剪葉提取總DNA，采用SSR-PCR技術(shù)進(jìn)行分子鑒定，參考Singh等[20]的方法，對(duì)雜交組合F1的基因組DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙稀酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有雙親特征條帶的即為真雜種，只有母本特征條帶而無父本特征帶的后代為假雜種或自交種。

1.2.2 正反交后代種植及主要農(nóng)藝性狀鑒定

2011年3月，將所有組合的真雜種移苗定植在廣西甘蔗研究所隆安實(shí)驗(yàn)基地，常規(guī)種植管理，大田生長(zhǎng)11個(gè)月后，于2012年2月砍莖留種并種植，每個(gè)單株種植12個(gè)芽，3次重復(fù)，按常規(guī)方法調(diào)查株高、莖徑、有效莖數(shù)、蔗汁垂度和自然條件下黑穗病發(fā)病率（種植田塊常年開展黑穗病抗性試驗(yàn)，對(duì)照種ROC22在2011年的黑穗病發(fā)病率為24%，2012年為22.9%）；2012年9月5日，利用SPAD-520型手持葉綠素儀，測(cè)定葉綠素含量，測(cè)定每個(gè)單株的主莖及所有分蘗的+1葉并取平均值。2012年12月砍收后，留宿根，2013年重復(fù)收集以上數(shù)據(jù)。

1.2.3 細(xì)胞質(zhì)源與農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析 編號(hào)為514、473、515和478的組合為2012～2013年雜交季新選配組合，只有雜種圃當(dāng)年數(shù)據(jù)；其余編號(hào)分別為102、68、92、107、135、138、47、48、100和132的組合將2012和2013年所調(diào)查的農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)平均，以正交組合后代群體和反交組合后代群體為2個(gè)獨(dú)立樣本，利用SAS8.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的均數(shù)t檢驗(yàn)，正交組合性狀和反交組合性狀間差異顯著的認(rèn)為正反交對(duì)該性狀有影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)錄入、整理和均數(shù)計(jì)算等采用Excel軟件，方差分析和均數(shù)t檢驗(yàn)利用SAS8.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)胞質(zhì)源對(duì)雜交后代真實(shí)性的影響

在66對(duì)SSR引物中篩選出18對(duì)具有雙親特征條帶的SSR引物，利用這18對(duì)SSR引物對(duì)5對(duì)正反交組合后代材料進(jìn)行鑒定，其中不具備父母本特征條帶的材料鑒定為自交種或假雜種；其余同時(shí)具有雙親的特征條帶的材料，鑒定為真雜種。如圖1所示，樣品2具有約50、250、270 bp大小的父本特征帶和約120 bp大小的母本特征帶，鑒定為真雜種；從圖2中可以看出，樣品18分別在大小約120、320、400、430 bp處具有父本特征帶，在大小約240 bp處具有母本特征條帶，鑒定為真雜種。

利用18對(duì)SSR引物共鑒定后代材料640個(gè)（表2），其中100和132組合共76個(gè)，47和48組合共149個(gè)，92和107組合共140個(gè)，102和68組合共143個(gè)，135和138組合共132個(gè)，真雜種率最高的組合為47組合，達(dá)到98.8%，最低的是102組合，僅為40.4%。真雜種率高于90%的3個(gè)組合47、92和68組合的母本細(xì)胞質(zhì)源都是Black Cheribon；在真雜種率低于70%的3個(gè)組合102組合、135組合和107組合中，有2個(gè)組合的母本細(xì)胞質(zhì)源為Bandjarmasim Hitam，1個(gè)組合的細(xì)胞質(zhì)源為Kaludia Boothan。

2.2 正反交組合主要性狀比較分析

對(duì)不同細(xì)胞質(zhì)來源的7對(duì)正反交組合的株高、莖徑、有效莖數(shù)、葉綠素含量以及自然條件下黑穗病的發(fā)病率共5個(gè)性狀進(jìn)行調(diào)查和分析（表3），除了515和473、514和481 2對(duì)4個(gè)組合的黑穗病發(fā)病率以及135和138組合的葉綠素含量在數(shù)值上有較大差異外，其余的 68和102、92和107組合的株高、莖徑、有效莖數(shù)、葉綠素含量以及100和132、47和48組合的葉綠素含量都差別不大。

2.3 細(xì)胞質(zhì)源與農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析

對(duì)參試的4個(gè)不同細(xì)胞質(zhì)源親本材料組配的正反交組合后代進(jìn)行t檢驗(yàn)（表4），發(fā)現(xiàn)參試組合的株高、莖稈和有效莖數(shù)都沒有明顯差異，135和138組合的葉綠素含量差異雖然達(dá)到顯著水平，但他們的母本細(xì)胞質(zhì)源同為Bandjarmasim Hitam，說明以上性狀主要受核基因控制，受正反交影響較小。515和481、514和473的黑穗病發(fā)病率分別為28.4和18.8、28.8和18.9，正反交之間t檢驗(yàn)證實(shí)P=0.006 36和P=0.007 81，2對(duì)正反交組合間差異都達(dá)到極顯著水平，而且這2對(duì)正反交組合的親本細(xì)胞質(zhì)源組成相同，都是Badila和Bandjarmasim Hitam，當(dāng)以細(xì)胞質(zhì)源同為Bandjarmasim Hitam的不同親本材料ROC22和ROC26作母本時(shí)，子代黑穗病發(fā)病率幾乎一致，為18.8%和18.9%，當(dāng)以細(xì)胞質(zhì)源為Badila的崖城58-47為母本分別與ROC22和ROC26配成正反交組合時(shí)，子代的黑穗病發(fā)病率也非常接近，分別為28.4%和28.8%。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同細(xì)胞質(zhì)源與真雜種率的關(guān)系

Wettstein[21]在1924年最早證實(shí)細(xì)胞質(zhì)基因與花粉育性相關(guān)。30年后，Michaelis[22]也在柳葉菜屬中證實(shí)細(xì)胞質(zhì)基因決定了花粉的育性。在其后的幾十年間，細(xì)胞質(zhì)基因與育性相關(guān)的研究理論被廣泛地研究和應(yīng)用。其中以細(xì)胞質(zhì)雄性不育為基礎(chǔ)的三系育種法在水稻[23-24]、小麥[25]、玉米[26]、甘藍(lán)[27-29]、煙草[30]等作物育種中發(fā)揮重要作用。雖然細(xì)胞質(zhì)基因與花粉育性的相關(guān)研究已經(jīng)開展了近一個(gè)世紀(jì)，但在甘蔗上卻未見相關(guān)報(bào)道。在本研究中，真雜種率高于90%的3個(gè)組合47、92和68組合的母本細(xì)胞質(zhì)源都是Black Cheribon，在真雜種率低于68.4%的3個(gè)組合102、135和107組合中，有2個(gè)組合的母本細(xì)胞質(zhì)源為Bandjarmasim Hitam，1個(gè)組合的細(xì)胞質(zhì)源為Kaludia Boothan。雖然Black Cheribon、Bandjarmasim Hitam和Kaludia Boothan這3個(gè)細(xì)胞質(zhì)同來源于甘蔗熱帶種，但對(duì)花粉育性的影響卻差異很大，說明其葉綠體基因和線粒體基因存在差異。巴西[31]和日本[32]分別對(duì)2個(gè)甘蔗栽培種SP80-3280和NCo 310的葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)品種的葉綠體基因組發(fā)生了1～2個(gè)堿基序列的改變，由于葉綠體基因和線粒體基因高度保守，1～2個(gè)堿基的差異也表明了2個(gè)品種在進(jìn)化上的趨異。在長(zhǎng)期的自然演化和人工選擇過程中，Black Cheribon、Bandjarmasim Hitam和Kaludia Boothan這3個(gè)細(xì)胞質(zhì)源累積的進(jìn)化和遺傳變異，也許就是該研究中不同甘蔗細(xì)胞質(zhì)源對(duì)甘蔗花粉育性產(chǎn)生不同影響進(jìn)而得到不同真雜種率的原因所在。

3.2 不同細(xì)胞質(zhì)源與農(nóng)藝性狀差異的關(guān)系

在筆者的研究中，參試的正反交組合在株高、莖徑、有效莖數(shù)差異不明顯，僅有3對(duì)正反交組合分別在感黑穗病率和葉綠素含量上有顯著差異，但葉綠素含量差異顯著的2個(gè)正反交組合的父母本的細(xì)胞質(zhì)源相同，說明葉綠體含量的差異并不是由細(xì)胞質(zhì)基因引起。可能的原因是株高、莖徑、有效莖及葉綠素含量等數(shù)量性狀，由大量微效基因的加性效應(yīng)控制，不同細(xì)胞質(zhì)源或是核質(zhì)互作效應(yīng)都可能對(duì)其產(chǎn)生較大影響，且由于甘蔗是復(fù)雜的非整倍體和多倍體植物，正反交后代核基因發(fā)生分離，正反交群體間，甚至是F1群體的個(gè)體間核基因都存在差異，這些差異很可能掩蓋了不同細(xì)胞質(zhì)基因?qū)π誀畹挠绊憽５贜atarajan等[33]的研究中證實(shí)，不同細(xì)胞質(zhì)材料作母本，對(duì)后代的有效莖數(shù)、株高、錘度等農(nóng)藝性狀有影響，以Co.678為母本正交時(shí)，其后代的株高明顯高于反交群體，當(dāng)以Co.527為母本時(shí)，正反交后代之間的有效莖數(shù)、錘度差異顯著；唐仕云等[12-13]也認(rèn)為，不同親本正反交對(duì)甘蔗后代開花特性、凈光合速率、株高、莖徑、錘度等性狀有顯著影響；Zhu等[34]檢測(cè)了4個(gè)甘蔗栽培種、8個(gè)割手密和3個(gè)具有割手密細(xì)胞質(zhì)源的雜交F1材料，在檢測(cè)的19個(gè)位點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)10個(gè)具有多態(tài)性。這進(jìn)一步說明細(xì)胞質(zhì)基因存在豐富的遺傳多態(tài)性。有可能本研究使用的甘蔗親本細(xì)胞質(zhì)源局限于甘蔗熱帶種，由于遺傳背景差異不大，也許不是一個(gè)好的分析群體。

3.3 不同細(xì)胞質(zhì)源與抗性的關(guān)系

Wang等[9]和徐乃瑜等[35]研究認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)基因與抗性密切相關(guān)；林日?qǐng)?jiān)[36]認(rèn)為，線粒體基因相比葉綠體基因?qū)鼓嫘院涂共⌒缘挠绊懜蟆Ｔ趧⒃讫埖萚37]對(duì)甘蔗細(xì)胞質(zhì)源與眼斑病抗性的關(guān)系研究中，發(fā)現(xiàn)Black Cheribon作為細(xì)胞質(zhì)源在抗性材料中的比例比在感性材料中的比例大29.0%，而且CP49-50（細(xì)胞質(zhì)源為Black Cheribon）與F134正交后代表現(xiàn)為抗，反交后代表現(xiàn)為感；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在抗性材料中有6個(gè)高抗品種，其中5個(gè)的父母本一方為CP49-50，說明Black Cheribon細(xì)胞質(zhì)源有利于提高甘蔗的眼斑病抗性。在本研究中，2對(duì)親本細(xì)胞質(zhì)源分別為Badila和Bandjarmasim Hitam的材料正反交，其組合間黑穗病的發(fā)病率差異都達(dá)到極顯著水平，而且以Badila細(xì)胞質(zhì)源的崖城58-47為母本組配的2個(gè)組合后代，子代的發(fā)病率非常接近為28.8%和28.4%。ROC22和ROC26的細(xì)胞質(zhì)源都為Bandjarmasim Hitam，分別以ROC22和ROC26為母本與崖城58-47組配時(shí)，其后代的黑穗病發(fā)病率也幾乎一致，為18.8%和18.9%，初步推斷Bandjarmasim Hitam細(xì)胞質(zhì)源對(duì)黑穗病的抗性顯著高于Badila，這值得進(jìn)一步研究。

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