張春　柳賴　鐘雄

摘 要 植物中的糖基轉(zhuǎn)移酶類能識別不同類型受體，最終生成多糖、復(fù)合糖、糖苷化合物等次生代謝產(chǎn)物。為了解其表達(dá)及調(diào)控機(jī)理，本研究利用同源克隆法從鐵皮石斛（Dendrobium officinale）原球莖中克隆了2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因DoGAUT1和DoPGSIP6，分別為2 518、2 010 bp，分別編碼了705、549個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)研究表明，它們同屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族8中GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶，DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列分別與二穗短柄草，大豆進(jìn)化關(guān)系最近。DoGAUT1為親水性跨膜蛋白，不含信號肽，亞細(xì)胞定位于高爾基體。DoPGSIP6為疏水性跨膜蛋白，含信號肽，亞細(xì)胞定位于質(zhì)膜。熒光定量PCR分析表明：DoGAUT1在一定晝夜溫差范圍內(nèi)，可響應(yīng)溫度調(diào)控，表現(xiàn)出上升趨勢，而DoPGSIP6在晝夜溫差為15 ℃時(shí)影響大。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；DoGAUT1基因；DoPGSIP6基因；克??；晝夜溫差；qPCR

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Glycosyltransferases（GTs）are able to recognize different kinds of receptors that finally produce secondary metabolites such as polysaccharides， complex carbohydrates and glycosyl compounds in plants. To further understand the biological function and the molecular mechanism， using protocorms as experimental materials， the glycosyltransferases genes of DoGAUT1 and DoPGSIP6 were cloned by homological cloning techniques in Dendrobium officinale. The full length sequences of cDNAs were 2 518 and 2 010 bp， encoding 705 amino acids and 549 amino acids， respectively. Bioinformatics analysis showed that they belonged to glycosyltransferases 8 with the GT-A fold. Amino acid sequence aligenment showed that DoGAUT1 and DoPGSIP6 displayed the closest evolutionary relationships to those of Brachypodium distachyon and Glycine max. DoGAUT1 protein was hydrophilic， without signal peptides and located in the Golgi. DoPGSIP6 protein was a high possibility of hydrophobic membrane protein with the existence of cleavage site for signal peptide in the plasma membrane. The qPCR analysis confirmed that DoGAUT1 gene was on the up trend in a certain day-and-night temperature difference， and DoPGSIP6 gene had the maximum effect with the day-and-night temperature difference of 15 ℃.

Key words Dendrobium officinale； DoGAUT1 gene； DoPGSIP6 gene； Cloning； Day-and-night temperature difference；qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.02.003

鐵皮石斛（Dendrobium officinale），屬蘭科石斛屬多年生草本植物，野生資源少，主要分布于東亞、東南亞等國家和地區(qū)[1]，福建主要集中分布于三明、德化、龍巖等地。鐵皮石斛含豐富的黏性物質(zhì)，其主要成分是水溶性多糖，具有降血糖、抗腫瘤、提高免疫力等功效[2-3]。因此，從分子水平上適度提高多糖的含量是當(dāng)前鐵皮石斛育種的一個(gè)重要方向。目前國內(nèi)外對鐵皮石斛多糖的研究主要集中在結(jié)構(gòu)功能研究、成分分析、遺傳標(biāo)記等方面[4-6]，而從分子水平上對多糖合成過程中相關(guān)酶基因的研究較少，對GAUT1和PGSIP6基因的研究集中在擬南芥的Galacturonosyltransferase 小基因家族上[7-9]。GAUT1（α-1，4-Galacturonosyltransferas）和PGSIP6（Glycogenin-like protein 6）分別是多糖（果膠）及葡糖醛酸木聚糖等糖類組分生物合成的關(guān)鍵酶[10-11]。近日，美國2所大學(xué)的研究人員在植物細(xì)胞壁形成問題上有了新的突破，研究人員確認(rèn)了2種蛋白質(zhì)，GAUT1和GAUT7共同形成了植物細(xì)胞壁中的果膠[12]。PGSIP超家族成員最早認(rèn)為參與淀粉合成，最近發(fā)現(xiàn)該家族中的部分成員參與木聚糖鏈的修飾[11，13-14]。GAUT1和PGSIP6屬于GT8（糖基轉(zhuǎn)移酶）家族基因，糖基轉(zhuǎn)移酶參與發(fā)育、次生代謝物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御等生物學(xué)過程[15-17]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中，則分別有同屬于41個(gè)GT家族的455和565個(gè)基因（http：//www.cazy.org/）（carbohydrate-active enZYmes，CAZy）。但到目前為止，絕大多數(shù)擬南芥和其他植物的GTs的功能和生化活性還不清楚。本文克隆鐵皮石斛糖基轉(zhuǎn)移酶DoGAUT1和DoPGSIP6基因并對其響應(yīng)晝夜溫差的表達(dá)分析，為研究鐵皮石斛多糖合成與DoGAUT1和DoPGSIP6酶活性關(guān)系及調(diào)控表達(dá)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛無菌苗為福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所保存，采自福建連城。

將無菌苗誘導(dǎo)的原球莖放于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，取未經(jīng)溫度處理的原球莖用于DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆，經(jīng)不同晝夜溫差處理的鐵皮石斛原球莖提取的RNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）操作，晝夜處理溫度分別為25/20、25/15、25/10 ℃。液體培養(yǎng)基的配方為1/2MS+50 g/L土豆汁，其中白糖20.0 g/L，pH值5.8，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 200～2 000 Lux，未經(jīng)處理的溫度為25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Tripure法[16]進(jìn)行鐵皮石斛原球莖總RNA的提取，提取得到的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經(jīng)分光光度計(jì)檢測其純度。以合格的總RNA為模板，試驗(yàn)中保守區(qū)擴(kuò)增、3′RACE以及開放閱讀框（ORF）驗(yàn)證過程中所用的cDNA的合成都是采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒，5′RACE 所需cDNA的合成采用System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的試劑盒進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的cDNA合成采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa），產(chǎn)物均置于-20 ℃保存。

1.2.2 鐵皮石斛的克隆 參考NCBI上與鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6基因相關(guān)序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物。根據(jù)DoGAUT1和DoPGSIP6基因的測序結(jié)果設(shè)計(jì)3′RACE的2條正向特異引物以及5′RACE的2條反向特異引物，3′末端序列下游錨定引物為AUAP：GGCCACGCGTCGACTAGTAC，5′末端序列上游錨定引物為UPM：CTAATACGACT

CACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT。將獲得的目的基因的5′RACE序列、ORF驗(yàn)證序列及3′RACE序列采用DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接，得到該基因的cDNA全長，并在ORF外或起始密碼子和終止密碼子處分別設(shè)計(jì)一對引物用于ORF的擴(kuò)增。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 kb/min；共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保持1 h。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖（1%）電泳進(jìn)行檢測。采用DNA快速純化回收試劑盒（Solarbio）回收目的片段，以pEASY-T5連接載體，再經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5α）、挑取單克隆、菌液PCR鑒定后，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。所有引物的序列、退火溫度及延伸時(shí)間見表1。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用在線ExPASy（http：//www.expasy.org/resources/）蛋白分析軟件Protparam、ProtSite、COIL、SWISS-MODEL分別對蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，功能位點(diǎn)預(yù)測，卷曲結(jié)構(gòu)預(yù)測，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用在線CBS Prediction Servers蛋白分析軟件中的SignalP、TMHMM、NetPhos對蛋白進(jìn)行信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和磷酸化位點(diǎn)分析；利用SignalP 4.1 Server進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用NCBI的Conserved Donain Search在線軟件進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；利用PredictProtein對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建DoGAUT1和DoPGSIP6的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用bootstrap法（重復(fù)1 000次）評估系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 不同溫度處理下鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析 本研究以18S rRNA為內(nèi)參基因，檢測目的基因DoGAUT1和DoPGSIP6的轉(zhuǎn)錄水平。18S rRNA、DoGAUT1和DoPGSIP6基因擴(kuò)增引物見上表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，反應(yīng)于羅氏LightCycler 480儀器中進(jìn)行，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)后，40 ℃冷卻30 s。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和溶解曲線等分析，檢測引物的特異性，各不同溫度處理的cDNA模板混合樣以不同梯度稀釋（5×、25×、125×、375×、625×），進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，獲得擴(kuò)增效率等相關(guān)參數(shù)，以上qPCR反應(yīng)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因克隆及序列分析

以鐵皮石斛原球莖的cDNA第一鏈為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得2條亮帶，與預(yù)期結(jié)果一致，測序得序列1長度為1 199 bp，序列2長度為364 bp。以獲得的部分序列為基礎(chǔ)，經(jīng)3′RACE，序列1和序列2分別獲得577和1 242 bp的片段，經(jīng)5′RACE，序列1和序列2分別獲得1 031和676 bp的片段。將所獲得的序列1和序列2的3′RACE、保守區(qū)序列和5′RACE序列分別進(jìn)行拼接，而后根據(jù)拼接的全長序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的ORF驗(yàn)證引物，分別擴(kuò)增得到2 154和936 bp的片段，測序結(jié)果與拼接結(jié)果相同。利用DNAman 7.0 軟件對獲得的2個(gè)基因全長 cDNA 序列進(jìn)行分析，序列1的全長為2 518 bp，包含107 bp的5′UTR，2 118 bp的 ORF以及293 bp的3′UTR（含poly A）。序列2的cDNA全長為2 010 bp，包含144 bp的5′UTR，1 650 bp的ORF以及216 bp的3′UTR（含poly A）。測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中在線進(jìn)行Blast，結(jié)果表明：序列1，序列2與已登錄GenBank的多種植物GAUT1和PGSIP6基因高度同源，可認(rèn)為是鐵皮石斛的GAUT1和PGSIP6基因，命名為DoGAUT1和DoPGSIP6基因，基因已登錄GenBank，登錄號為1740985。

2.2 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質(zhì)一級序列分析

采用ExPASy Protparam工具對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示見表2，并且脂溶系數(shù)分別為86.62和93.19，一般認(rèn)為DoGAUT1蛋白為不穩(wěn)定的脂溶性蛋白，DoPGSIP6蛋白為穩(wěn)定的脂溶性蛋白。利用ProtScale預(yù)測可知DoGAUT1最大的疏水性值為3.344，最大的親水性值為-3.433，預(yù)測結(jié)果顯示為親水性，而DoPGSIP6最大的疏水性值為3.222，最大的親水性值為-2.500，預(yù)測結(jié)果說明DoPGSIP6是個(gè)小的疏水蛋白。

利用TMHMM Server v. 2.0工具對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，如圖1、2所示，結(jié)果表明：DoGAUT1可能會(huì)在28～50位氨基酸處形成一個(gè)跨膜螺旋， DoGAUT1蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為20.681 79大于18，因此該蛋白很可能是跨膜蛋白。從N末端開始的前60個(gè)氨基酸期望值（Exp number， first 60 Aas）為20.673 38，大于10，結(jié)合SignalP 4.1 Serve分析，得出該區(qū)域是跨膜結(jié)構(gòu)域而非信號肽。DoPGSIP6可能會(huì)在377～399、412～434、473～495、500～522位氨基酸處形成跨膜螺旋，DoPGSIP6蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為117.916 68遠(yuǎn)大于18，因此該蛋白很可能是一個(gè)跨膜蛋白。從N末端開始的前60個(gè)氨基酸期望值（Exp number， first 60 Aas）為2.192 4，小于10，對于含有2個(gè)以上跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，TMHMM認(rèn)為不含信號肽，運(yùn)用SignalP 4.1 Server加以分析得出信號肽的位置1～25。綜上表明 DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白均為跨膜蛋白（結(jié)合TMpred分析），DoGAUT1蛋白不含有信號肽，而DoPGSIP6含有信號肽。

利用COILS對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白進(jìn)行蛋白卷曲螺旋預(yù)測，結(jié)果顯示：DoGAUT1蛋白的氨基酸序列在190～217，264～293，327～355形成卷曲螺旋的概率分別是0.549，0.604，0.848。而鐵皮石斛DoPGSIP6蛋白在window=14，21和28時(shí)，形成卷曲螺旋的預(yù)測概率均低于0.5，說明鐵皮石斛DoPGSIP6蛋白不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明在多肽鏈中可能發(fā)生磷酸化的有絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）。DoGAUT1蛋白中以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，有26個(gè)，預(yù)測該位點(diǎn)比較集中的區(qū)域序列都是非保守區(qū)；其次是酪氨酸，達(dá)到6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為第55、319、500、505、568、690位氨基酸處；蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)有5個(gè)，分別在第3、138、245、325、450位氨基酸處。DoPGSIP6蛋白的氨基酸序列發(fā)生磷酸化修飾的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）個(gè)數(shù)分別23、6和7個(gè)。通過Prosite 在線軟件進(jìn)一步預(yù)測鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6潛在蛋白功能位點(diǎn)。結(jié)果表明，DoGAUT1蛋白含4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、9個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)、4 個(gè)N-?；稽c(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)cAMP-cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。DoPGSIP6蛋白潛在的N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、N-?；稽c(diǎn)、ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)基序A（P-loop）位點(diǎn)分別是1、7、6、11和1個(gè)，共26個(gè)。

2.3 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析

利用PredictProtein對鐵皮石斛HMGR蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果為：DoGAUT1、DoPGSIP6的無規(guī)則卷曲所占比例為35.89%、52.46%；α螺旋為56.6%、39.16%；β螺旋為7.52%、8.38%。

運(yùn)用PSORT軟件對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明：鐵皮石斛DoGAUT1蛋白定位于高爾基體概率為90%，而DoPGSIP6蛋白定位于質(zhì)膜的概率為64%，定位于高爾基體概率為46%。

2.4 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質(zhì)超二級結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI-CDS在線軟件分析鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，見圖3、圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DoGAUT1蛋白在第394～692 位含有典型的GT8_like_1未知功能的保守結(jié)構(gòu)域，多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。而DoPGSIP6蛋白在第29～276 位含有GT8_Glycogenin保守結(jié)構(gòu)域，多個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)錳結(jié)合位點(diǎn)。它還含有一個(gè)保守基因序列DXD，主要負(fù)責(zé)將不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上。此外，該蛋白在第448～522 位含有CCC1_like保守結(jié)構(gòu)域，它具有固氮的作用。DoGAUT1和DoPGSIP6含有GT8家族的序列相關(guān)區(qū)域，結(jié)構(gòu)上屬于GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶，按糖基化的反應(yīng)機(jī)制，為保留型糖基轉(zhuǎn)移酶。

2.5 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

利用SWISSMODEL對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白進(jìn)行分析，得到其三維結(jié)構(gòu)如圖5所示，左圖為DoGAUT1，右圖為DoPGSIP6，可以看出該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲。

2.6 DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的同源性分析

利用DNANAN軟件分別對DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列與GenBank上公布的擬南芥Arabidopsis thaliana、二穗短柄草Brachypodium distachyon、黃瓜Cucumis sativus、馬鈴薯Solanum tuberosum，擬南芥Arabidopsis thaliana、短花藥野生稻Oryza brachyantha、番茄Solanum lycopersicum、馬鈴薯Solanum tuberosum、可可Theobroma cacao中的同源序列進(jìn)行多序列比對。分析結(jié)果表明，不同植物的之間均具有較高的相似性，DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸相似性分別達(dá)到63.01%和73.72%，并且C端都存在一段保守序列，這段序列被稱為PSPG 結(jié)構(gòu)域（圖6、7），該結(jié)構(gòu)域是植物中參與次級代謝產(chǎn)物糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶的信號模塊。為進(jìn)一步明確進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建DoGAUT1和DoPGSIP6的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。從進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，DoGAUT1與單子葉禾本科植物的二穗短柄草親緣關(guān)系較近，聚為同一類，而與雙子葉茄科的番茄等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。DoPGSIP6與蝶形花科的大豆聚為一類，與蕓香科柑橘屬的甜橙關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.7 鐵皮石斛原球莖中不同溫度處理下DoGAUT1和DoPGSIP6基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析

在溶解曲線、擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足試驗(yàn)要求的前提下，以18S rRNA為內(nèi)參基因，檢測鐵皮石斛原球莖中不同溫度處理下DoGAUT1和DoPGSIP6基因的表達(dá)水平，其相對表達(dá)量見圖9、圖10。DoGAUT1基因在不同溫度不同處理時(shí)間下其相對表達(dá)量均比對照（0 d）的高；晝夜溫差為10 ℃，是比較理想的處理溫度，隨著處理天數(shù)的增加，DoGAUT1的表達(dá)量逐漸上升，處理10 d，表達(dá)水平最高，是對照的9倍；當(dāng)晝夜溫差為5 ℃時(shí)，處理10 d，效果最好；當(dāng)溫差為15 ℃，表達(dá)相對沒有規(guī)律，而且表達(dá)量較低。DoPGSIP6基因同樣是在溫差為10 ℃時(shí)表達(dá)量呈上升趨勢；當(dāng)溫差為15 ℃，處理2 d時(shí)，表達(dá)水平約為對照的4倍，而處理10 d后，基因反而比對照低；當(dāng)溫差為5 ℃時(shí)，DoPGSIP6基因幾乎不表達(dá)。以上結(jié)果表明DoGAUT1、DoPGSIP6基因可能受溫差的直接特異誘導(dǎo)而且與溫差的大小和處理時(shí)間相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

3.1 鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能預(yù)測

DoGAUT1和DoPGSIP6基因都編碼NDP-sugar轉(zhuǎn)移酶超家族蛋白，含有GT8家族的序列相關(guān)區(qū)域，結(jié)構(gòu)上屬于GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶，然而它們的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)并不具有同源性，即使這2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因之間親緣關(guān)系的很近，我們也不能準(zhǔn)確推斷其生物學(xué)功能，研究表明UrdGT1b和UrdGT1c在氨基酸水平上具有91%一致性，但是它們卻轉(zhuǎn)運(yùn)不同的己糖[18]。將獲得的鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6推定的氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)不同種屬同一糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性極大，這說明酶的進(jìn)化是相當(dāng)保守的[19]，進(jìn)化樹分析表明，DoGAUT1與二穗短柄草親緣關(guān)系較近，DoPGSIP6與大豆聚為一類。生物信息學(xué)分析，DoGAUT1是親水性跨膜蛋白，DoPGSIP6屬于疏水性的跨膜蛋白，此外DoGAUT1的糖基化位點(diǎn)更多，可能原因是糖基化的發(fā)生增加了蛋白的親水性，從側(cè)面解釋了疏水蛋白DoPGSIP穩(wěn)定存在的原因。GAUT1和PGSIP6在擬南芥均定位于高爾基體上[20-21]，預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，不同的是DoPGSIP6蛋白定位于質(zhì)膜的概率為64%，定位于高爾基體概率為46%，推測DoPGSIP6蛋白是在高爾基體上完成修飾和包裝，被錨定在膜上。發(fā)現(xiàn)在重要功能域方面，鐵皮石斛DoGAUT1酶含有2個(gè)金屬離子位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鐵皮石斛鎂等離子含量較高，這些離子對果膠有封閉作用，影響果膠轉(zhuǎn)化為水溶性果膠[22]，這可能是不同地區(qū)鐵皮石斛多糖成分不一樣的原因。與DoPGSIP6所不同的是DoGAUT1具有一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，提示了該基因可能參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[23]。DoPGSIP6酶含有GT-A型的普遍有的2個(gè)相連的“Rossmann”樣的折疊區(qū)，具有一個(gè)DXD基序，提供錳離子的結(jié)合位點(diǎn)，功能是不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上，這可能決定著該基因與修飾多糖合成有關(guān)。此外，DoPGSIP6蛋白有CCC1_like保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與植物固氮有關(guān)，關(guān)于DoPGSIP6蛋白是否具有固氮作用有待進(jìn)一步研究。

3.2 DoGAUT1和DoPGSIP6參與多糖的合成可能受晝夜溫差的調(diào)控

多糖的合成酶主要包括合成不同核苷糖的轉(zhuǎn)換酶和合成多糖的糖基轉(zhuǎn)移酶。核苷糖通過不同的酶促反應(yīng)相互轉(zhuǎn)換，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，合成多糖[24]。從微生物的多糖合成途徑可推測植物中多糖的合成也是相當(dāng)復(fù)雜的[25-26]。而糖基轉(zhuǎn)移酶作為植物自身防御的第一道防線，能夠不斷緩沖環(huán)境壓力并做出適應(yīng)環(huán)境變化的改變，它們在植物次生代謝中具有很高的可塑性，能夠高速周轉(zhuǎn)[27]。祁秋霞[28]通過對不同溫度條件下的海洋微藻的生物量和多糖含量的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同的溫度對微藻生長及體內(nèi)多糖含量的變化有重要的影響，20～25 ℃有利于微藻的生長，10～15 ℃則有利于微藻多糖的積累。粟君等[29]在青錢柳的研究上發(fā)現(xiàn)了相對的適溫有利于植物次生代謝物的積累，過高和過低都不利于青錢柳多糖的積累。張宇斌等[30]研究表明溫度對鐵皮石斛的凈光合速率有明顯的影響，在 20 ℃時(shí)凈光合速率最大，較有利于鐵皮石斛的生長。李江等[31]在南極菌Pseudoaltermonassp.S-15-13胞外多糖的研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過重復(fù)的凍融循環(huán)后，南極菌S-15-13糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量明顯提高，在第2個(gè)凍融循環(huán)后，糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量較對照提高了3.667倍。Mancuso等[32]報(bào)道從南極海冰和海水中分離的南極菌cAM025EPSs的產(chǎn)量在-2和10 ℃時(shí)比其在20 ℃時(shí)高出30 倍，南極菌通過提高多糖生物合成酶的表達(dá)，以大量合成胞外多糖，從而保護(hù)菌體免受低溫及重復(fù)凍融的傷害。本研究通過晝夜溫差調(diào)控鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6表達(dá)分析，表明晝夜溫差為25/15 ℃，DoGAUT1基因表達(dá)水平呈直線上升，鐵皮石斛通過DoGAUT1基因的表達(dá)合成多糖，該現(xiàn)象符合次生代謝物的積累規(guī)律。而DoPGSIP6基因在25/15 ℃處理2 d表達(dá)量急劇上升，以大量合成胞外多糖，該多糖的作用可能是保護(hù)鐵皮石斛免受低溫的傷害，這與南極菌胞外糖功能類似。

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