郭冬等

摘 要 利用同源克隆的方法在橡膠樹中獲得一個(gè)新的法尼基焦磷酸合酶基因，命名為HbFPS2。序列分析顯示，HbFPS2基因組序列長(zhǎng)4 171 bp，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，cDNA全長(zhǎng)1 288 bp，包含1 029 bp的開放閱讀框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR，編碼342個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為39.6 ku，等電點(diǎn)為5.27。氨基酸序列比對(duì)顯示，HbFPS2具有FPS家族保守的5個(gè)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析結(jié)果表明，HbFPS2和HbFPS1親緣關(guān)系最近，與大戟科的蓖麻、大戟、麻風(fēng)樹法尼基焦磷酸合酶聚為一個(gè)亞類。定量PCR結(jié)果表明，HbFPS2在橡膠樹根、樹皮、葉、花和膠乳等組織中均有表達(dá)，在花和膠乳中表達(dá)量較高，在根中表達(dá)量最低；茉莉酸和乙烯處理均能提高HbFPS2基因的表達(dá)量，處理9 h時(shí)基因表達(dá)量分別提高了36倍和8倍。結(jié)果為分析法尼基焦磷酸合酶基因表達(dá)特性及其在天然橡膠生物合成途徑中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；法尼基焦磷酸合酶；特異表達(dá)；茉莉酸；乙烯

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Farnesyl pyrophosphate synthase is a key enzyme in nature rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis. In this study， a new gene coding for farnesyl pyrophosphate synthase， designated as HbFPS2， was isolated by homology-based candidate gene method in Hevea brasiliensis. Sequence analysis revealed that the HbFPS2 genome sequence is 4 171 bp， contained 12 exons and 11 introns. The full-length cDNA of HbFPS2 is 1 288 bp with 1 029 bp open reading frame， encoding 342 amino acid residues with molecular mass of 39.6 ku， and pI 5.27. Multiple sequence alignment showed that the HbFPS2 included 5 domains with highly conserved amino acids. The phylogenetic analyses revealed that HbFPS2 belong to plant farnesyl pyrophosphate synthase family， in which Hevea brasiliensis， Ricinus communis， Euphorbia pekinensis and Jatropha curcas were clustered into one clade. The results of real time PCR analysis indicated that HbFPS2 expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， followed by the latex， and lowest in the roots. The transcription of HbFPS2 was induced in the latex by jasmonic acid and ethylene， increased 36 and 8-fold respectively. This research lays a foundation for studying the gene expression pattern and regulating mechanisms of HbFPS2 in nature rubber biosynthesis.

Key word Hevea brasiliensis； Farnesyl pyrophosphate synthase； Differential expression； Jasmonic acid； Ethylene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.001

橡膠樹法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）是天然橡膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來(lái)源。天然橡膠是異戊二烯代謝途徑的一個(gè)重要產(chǎn)物之一，同位示蹤術(shù)和核磁共振成像技術(shù)研究結(jié)果表明，法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）是橡膠生物合成的起始物[1]。法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS，EC2. 5. 1/EC2. 5. 1. 10）是植物類異戊二烯合成途徑中的一個(gè)重要關(guān)鍵酶，催化兩分子的異戊烯基焦磷酸和一分子的二甲基丙烯基焦磷酸以1，4頭尾連續(xù)縮合反應(yīng)，形成15碳的FPP[2]。FPP還是植物體內(nèi)甾醇、三萜、長(zhǎng)醇、泛醌、類胡蘿卜素等許多萜類衍生物質(zhì)合成的前體物和蛋白質(zhì)法尼基化的底物[3]。

FPS作為一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，研究最為廣泛。20世紀(jì)90年代以來(lái)人們已經(jīng)通過(guò)不同方法從橡膠樹[4]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[5]、 白羽扇豆（Lupinus albus）[6-7]、水稻（Oryza sativa）[8]、番茄（Lycoperscion esculentum）[9]、玉米（Zea mays）[10]、青蒿（Artemisia annua）[11-12]、銀膠菊（Parthenium argentatum）[13]、人參（Panax ginseng）[14]、銀杏（Ginkgo biloba）[15]等幾十種植物中克隆出編碼FPS的基因。通過(guò)對(duì)多個(gè)物種的FPS序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源不同的FPS序列具有高度相似性，含有5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域（Ⅰ-Ⅴ）[15]，其中2個(gè)富含天冬氨酸的DDXXD（D代表天冬氨酸，X代表任意氨基酸）結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅴ，被認(rèn)為是酶活性中心組成部分，對(duì)催化功能起決定作用[16]。FPS是一類代謝同工酶，是一個(gè)小的基因家族編碼產(chǎn)物。在擬南芥、水稻、青蒿、白羽扇豆、銀膠菊等植物中存在至少2個(gè)FPS基因同分異構(gòu)體組成的基因家族。目前橡膠樹中除已分離出的HbFPS1基因外[4]，還未見有新的FPS家族成員報(bào)道。

本研究運(yùn)用同源序列法和快速cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆橡膠樹新的法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS2，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用定量PCR技術(shù)比較HbFPS2在橡膠樹不同組織中的表達(dá)情況，并研究了茉莉酸和乙烯處理對(duì)膠乳中HbFPS2表達(dá)情況的影響，為進(jìn)一步研究法尼基焦磷酸和酶基因在天然橡膠生物合成途徑中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 橡膠樹膠乳、樹皮、根、花和樹葉等組織均采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)的熱研7-33-97品系巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）。膠乳采樣按Tang等[17]的方法進(jìn)行，然后用液氮收集。樹皮、根、花和樹葉采集后用液氮研磨，保存于-70 ℃。茉莉酸和乙烯利處理橡膠樹按照Chen等[18]的方法進(jìn)行。

1.1.2 質(zhì)粒、試劑和菌種 克隆載體pMD19T simple Vector、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均購(gòu)自TaKaRa公司。E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。其它生化試劑和常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹RNA的提取 參照Tang等[17]的提取方法進(jìn)行。

1.2.2 HbFPS基因家族的同源檢索及基因組序列拼接及驗(yàn)證 按照Yang等[19]方法在NCBI中將橡膠樹基因組序列（GenBank：AJJZ01000000）[20]和ncbi-blast-2.2.28t-win32軟件下載，并按照BLAST Command Line Applications User Manual操作，構(gòu)建橡膠樹基因組本地化Blast檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。使用HbFPS1的編碼序列檢索橡膠樹基因組本地化數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得HbFPS1同源序列，使用DNAMAN對(duì)基因組序列進(jìn)行拼接。將檢索獲得新基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增橡膠樹cDNA進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbFPS2的克隆

使用Adiwilaga和Kush[4]分離的HbFPS1編碼序列（GenBank登錄號(hào)：Z49786）檢索本地化橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索結(jié)果顯示，橡膠樹基因組序列中有兩段與HbFPS1有較高同源性，其中AJJZ010231605共3 984 bp，部分序列與HbFPS1編碼序列的1～545 bp同源；AJJZ010231606共12 573 bp，部分序列與HbFPS1編碼序列547～1 029 bp同源，AJJZ010231605和AJJZ010231606的基因組序列不存在重疊區(qū)段。筆者推測(cè)這2個(gè)序列為同一基因的2個(gè)片段，因此設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增橡膠樹膠乳cDNA第一鏈，獲得約1.1 kb的特異擴(kuò)增條帶（圖1-A），PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，序列共1 070 bp，其中包含一個(gè)1 029 bp的ORF，與AJJZ010231605和AJJZ010231606拼接后的編碼區(qū)外顯子部分完全一致，表明AJJZ010231605和AJJZ010231606確實(shí)為同一基因的2個(gè)片段，將該基因命名為HbFPS2。通過(guò)5′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到約240 bp片段（圖1-B），經(jīng)測(cè)序獲得105 bp的5′-UTR序列；通過(guò)3′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到約260 bp片段（圖1-C），經(jīng)測(cè)序獲得154 bp的3′-UTR序列（圖1-C），共得到1 288 bp的HbFPS2全長(zhǎng)cDNA序列（圖2）。使用引物FPS2F和FPS2R擴(kuò)增膠乳cDNA，獲得約1.3 kb片段（圖1-D），測(cè)序結(jié)果與拼接后序列一致。

2.2 HbFPS2序列分析

利用primer5.0分析HbFPS2的完整閱讀框?yàn)? 029 bp，對(duì)應(yīng)基因組序列4 171 bp，編碼342個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為39.6 ku，等電點(diǎn)為5.27。HbFPS2編碼區(qū)與HbFPS1相比，核酸水平的相似性為92.42%，推導(dǎo)的氨基酸序列相似性為90.94%。利用在線軟件GSDS對(duì)HbFPS2的編碼序列和基因組序列比對(duì)顯示，和HbFPS1一樣，HbFPS2也由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子與內(nèi)含子的連接都符合“GT-AG”規(guī)則（圖3）。從圖中可以看出HbFPS1和HbFPS2的基因結(jié)構(gòu)相似，12個(gè)外顯子的長(zhǎng)度和分布一致，顯示出較強(qiáng)的保守性。

將橡膠樹和擬南芥、番茄、玉米、水稻等植物的FPS氨基酸序列比對(duì)顯示，HbFPS與擬南芥AtFPS1、AtFPS2、番茄LeFPS1、玉米ZmFPS、水稻OsFPS1、OsFPs2的同源性分別為77.49%、78.07%、76.61%、72.51%、71.64%和71.05%，表明各物種FPS基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析表明，HbFPS2的功能域氨基酸組成與其他植物一致，均含有5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域II和V富含天冬氨酸結(jié)構(gòu)域（DDXXD），被認(rèn)為是烯丙基轉(zhuǎn)移酶與底物異戊烯基焦磷酸相結(jié)合的位點(diǎn)（圖4）。

2.3 HbFPS2進(jìn)化分析

對(duì)橡膠樹、擬南芥、水稻、番茄、玉米、青蒿、銀膠菊、白羽扇豆、人參、蓖麻（Ricinus communis）、大戟（Euphorbia pekinensis）、銀杏、歐洲云杉（Picea abies）、洋甘菊（Matricaria chamomilla）、三七（Panax notoginseng）、曼地亞紅豆杉（Taxus x media）、辣椒（Capsicum annuum）、向日葵（Helianthus annuus）、大豆（Glycine max）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）等20個(gè)物種的27個(gè)FPS氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析，結(jié)果見圖5所示。27個(gè)FPS氨基酸序列被聚為兩大類，雙子葉植物分為一類（A-F），單子葉植物和裸子植物聚為一類（G和H）。從圖5可以看出，HbFPS2和HbFPS1的親緣關(guān)系最近，與麻風(fēng)樹、大戟、蓖麻聚為雙子葉植物中的大戟科分支（A）；其他雙子葉植物又分別聚為豆科（B）、十字花科（C）、茄科（D）、五加科（E）和菊科（D）等不同分支。

2.4 HbFPS2的組織特異性表達(dá)

定量PCR分析橡膠樹根、樹皮、葉、花和膠乳等組織中HbFPS2的表達(dá)情況，結(jié)果表明，HbFPS2基因在所有組織中均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高，膠乳次之，在根中表達(dá)量最低（圖6）；同時(shí)筆者也分析了HbFPS1基因在這些組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，HbFPS1基因在所有組織中均有表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量也是最低，在膠乳中的表達(dá)量顯著高于其它組織，是根中表達(dá)量的65倍（圖6）。HbFPS1在各組織的表達(dá)量均高于HbFPS2，在根、樹皮、葉、花和膠乳中表達(dá)量分別為HbFPS2的16.9、33.5、30.3、7.1和318.2倍。

2.5 茉莉酸和乙烯處理對(duì)膠乳中HbFPS2基因表達(dá)的影響

定量PCR分析茉莉酸和乙烯處理后膠乳中HbFPS2的表達(dá)情況見圖7。由圖7可知，茉莉酸和乙烯誘導(dǎo)HbFPS2和HbFPS2的表達(dá)量都在9 h時(shí)達(dá)到最高水平。茉莉酸誘導(dǎo)9 h時(shí)，HbFPS2和HbFPS1的表達(dá)量都顯著增加，分別是0 h的36倍和29倍；乙烯誘導(dǎo)9 h時(shí)，HbFPS2和HbFPS1的表達(dá)量增加不如茉莉酸顯著，分別是0 h的8倍和7倍。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)合橡膠樹基因組序列，利用同源序列法分離出一個(gè)新的基因HbFPS2。基因結(jié)構(gòu)分析表明，HbFPS2和HbFPS1基因結(jié)構(gòu)相似，外顯子的位置和長(zhǎng)度完全一致；推導(dǎo)的氨基酸序列與模式植物的FPS氨基酸序列具有較高的同源性，都具有FPS的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，表明結(jié)構(gòu)域在分子進(jìn)化過(guò)程中具有較高的穩(wěn)定性，這可能與其在生物代謝中行使同一功能相關(guān)。兩個(gè)富含天冬氨酸的結(jié)構(gòu)域DDXXD被認(rèn)為是酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)，是這一類酶的活性中心[3]。這表明克隆的HbFPS2屬于FPS基因家族，在以前的研究中還未見報(bào)道。進(jìn)化分析顯示，22種植物的FPS聚被為裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物三大類，HbFPS2與親緣關(guān)系較近的大戟科植物聚為雙子葉植物下的一個(gè)亞類，這也說(shuō)明了植物在長(zhǎng)期的分子進(jìn)化過(guò)程中， 生物種屬間的基因序列存在一定的同源性， 而同源性的高低與植物親緣關(guān)系密切相關(guān)。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為，植物FPS基因表達(dá)具有組織特異性，并且伴隨著類異戊二烯衍生物含量的而增加[22]。本研究中基因組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示，HbFPS2和HbFPS1在橡膠樹各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在各組織中表達(dá)強(qiáng)弱存在差異，具有組織特異性。HbFPS1在膠乳中高水平表達(dá)，在其它組織中表達(dá)水平較低，在根中表達(dá)最低；相對(duì)HbFPS1而言，HbFPS2在橡膠樹中以較低水平表達(dá)，且在花中表達(dá)水平最高，膠乳次之，根中最低。HbFPS2和HbFPS1表達(dá)的差異，推測(cè)在橡膠樹各組織中，HbFPS1在催化生成法尼基焦磷酸中可能起著主要作用。

茉莉酸和乙烯被認(rèn)為參與天然橡膠的生物合成調(diào)控[23]，定量PCR研究顯示，用茉莉酸和乙烯處理橡膠樹，膠乳中均檢測(cè)到HbFPS2和HbFPS1表達(dá)量有所上升，同一種激素處理對(duì)這兩個(gè)基因的影響較為一致，我們推測(cè)在膠乳中可能HbFPS2和HbFPS1都參與了橡膠的生物合成，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究；相比較而言，茉莉酸對(duì)HbFPS2和HbFPS1的影響較乙烯更為顯著，推測(cè)這兩個(gè)基因可能受茉莉酸或乙烯信號(hào)的調(diào)控比較一致，有待分離HbFPS2調(diào)控序列后進(jìn)行更進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步探索橡膠樹法尼基焦磷酸合酶在天然橡膠生物合成中的作用機(jī)制、基因調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

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