摘 要 為了研究花生屬異源多倍體進(jìn)化過程中的生理特性遺傳變化規(guī)律，以花生區(qū)組栽野種間雜種F1、早期多倍體世代（S0～S3）及其親本為材料，分析植株葉片中的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和葉綠素含量以及過氧化物酶活性等抗病抗逆相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化特征。結(jié)果表明，雜種F1代各項(xiàng)生理指標(biāo)都高于親本，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢；染色體加倍后的S0～S1代植株葉片中的POD活性、脯氨酸含量和葉綠素含量均高于F1代，S1～S3代各項(xiàng)生理指標(biāo)伴隨著自交代數(shù)的增加而逐漸降低，但仍高于母本栽培種，說明染色體加倍后的多倍體植株可能具有更強(qiáng)的抗病、抗旱等抗逆和環(huán)境適應(yīng)能力。

關(guān)鍵詞 花生；種間雜交；異源多倍化；生理特性

中圖分類號 S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract To study the mechanisms of genetic variation on physiological property of Arachis allopolyploidization， the variation characteristics of physiological and biochemical indexes related to disease/stress resistance（POD activity， Proline， MDA， soluble sugar and chlorophyll content）was studied using the progenitors， F1 hybrid and early polyploidy generations（S0 to S3）of the hybridization between tetraploid cultivated peanut and diploid wild peanut A. doigoi as materials. The results indicated that：（1）All the five physiological property indexes of F1 hybrid were higher than their progenitors， which showed obviously heterosis；（2）After chromosome doubling， POD activity， Proline and chlorophyll content of S0～S1 were higher than F1 hybrid；（3）All the five physiological property indexes of S1～S3 declined along with the self-cross course but higher than their progenitors， which indicated that allopolyploidy had better environment suitability and resistance capability to disease resistance and drought tolerance. This study provided useful important information for revealing the mechanism of peanut allopolyploidy evolution. Additional， it had vital significance to guide the peanut interspecific hybridization breeding.

Key words Peanut； Interspecific hybridization； Allopolyploidization； Physiological property

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.008

多倍化是高等植物基因組的顯著特征之一，多倍體植物中以異源多倍體居多，種間雜交和染色體加倍是形成異源多倍體的主要途徑，通過此途徑形成的異源多倍體兼具雜種和多倍體雙重優(yōu)勢且克服了遠(yuǎn)緣雜種不育的障礙，因而被作物遺傳育種學(xué)家廣泛應(yīng)用于作物品種改良中[1]。異源多倍化不是兩個(gè)基因組的簡單融合，而是涉及到大范圍的分子調(diào)整和變化[2-6]，從而引起一系列的形態(tài)、生理及代謝過程的變化，如黃瓜單位面積的葉綠素a、b及其總含量、MDH的表達(dá)量均隨著倍性增加而增加[7]；四倍體何首烏的SOD、POD和APX活性均明顯高于二倍體[8]；三倍體、四倍體西瓜番茄紅素的含量明顯高于二倍體[9]；四倍體玉米籽粒內(nèi)類胡蘿卜素含量比二倍體增加43%[10]。因此，探明植物多倍體進(jìn)化過程中的不同倍性材料生理生化水平上的差異不僅對種間雜交育種具有重要指導(dǎo)意義，同時(shí)也可為闡明植物多倍體進(jìn)化機(jī)制提供有用的信息[3，11]。

花生屬由3個(gè)四倍體種和近80個(gè)二倍體種組成，其中的四倍體栽培種花生（2n=40，AABB）是世界上最重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一?；ㄉ鷮俜N間雜交是異源多倍化過程，國內(nèi)外關(guān)于四倍體栽培種花生二倍體祖先的研究比較多，目前認(rèn)為A.duranensis和A. ipaensis最有可能是栽培種A基因組和B基因組的提供者[12-15]，但就種間雜交異源多倍體進(jìn)化過程中的相關(guān)機(jī)制研究甚少，Garcia等[16]和賀梁瓊等[17-19]對該物種種間雜交的回交各世代和早期多倍體世代基因組的遺傳繼承及丟失、基因表達(dá)變化進(jìn)行過報(bào)道，目前尚未有該物種異源多倍體進(jìn)化過程中生理特性變化研究的相關(guān)報(bào)道。本研究以花生屬四倍體栽培種花生仲愷花4號與二倍體野生種花生A. doigoi雜交產(chǎn)生的種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及其親本為材料，研究與抗病抗逆相關(guān)的生理生化指標(biāo)在該組合多倍體進(jìn)化過程中的變化特點(diǎn)，為花生屬種間雜交育種實(shí)踐和深入研究花生屬多倍體進(jìn)化機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生屬四倍體栽培種花生仲愷花4號和二倍體野生種花生A. doigoi（PI 276235）種間雜交獲得不育的三倍體雜種F1，F(xiàn)1植株經(jīng)0.2%秋水仙堿誘導(dǎo)加倍處理獲得部分恢復(fù)育性的人工異源六倍體S0植株，S0連續(xù)自交3代獲得S1、S2和S3等早期異源多倍體世代群體，各世代的植株采取搭建小拱棚過冬和春季扦插幼嫩枝條的方法保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)基地，每個(gè)世代隨機(jī)選取7株第4片展開葉[20]進(jìn)行各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測定。

1.2 方法

植株葉片中的可溶性糖、脯氨酸含量和過氧化物酶（POD）活性按照李合生[21]主編的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)》中的方法進(jìn)行測定，分別采用蒽酮比色法、磺基水楊酸法和愈創(chuàng)木酚法；采用硫代巴比妥方法測定丙二醛含量[22]；葉綠素含量的測定采用KONICAL公司的Chlorophyll meter SPAD-502便攜式葉綠素測定儀自動(dòng)測量。變異系數(shù)CV （Coefficient of Variance）是標(biāo)準(zhǔn)差與均值的比值，通過公式CV=σ/μ計(jì)算獲得。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Microsoft Excel（Office 2007）軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，采用 SPSS17.0軟件中Duncan方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間POD活性比較

對種間雜種F1、早期異源多倍體世代S0～S3及兩親本植株葉片中的POD活性進(jìn)行比較（圖1），二倍體野生種花生父本植株葉片中的POD活性為146.54 μmol/（min·g FW），四倍體栽培種花生母本植株葉片中的POD活性為108.51 μmol/（min·g FW），父本植株中的POD活性要高出母本植株38.03 μmol/（min·g FW）；雜交F1代植株葉片中的POD活性為152.91 μmol/（min·g FW），分別高出母本、父本植株44.4 μmol/（min·g FW）和6.37 μmol/（min·g FW）；染色體加倍后，S0代植株葉片中的POD活性為218.46 μmol/（min·g FW），S1代植株葉片中的POD活性為240.59 μmol/（min·g FW），分別高于F1代植株65.55 μmol/（min·g FW）和87.68 μmol/（min·g FW），但隨著自交代數(shù)的繼續(xù)增加，POD活性不斷下降，到S3代時(shí)，其葉片中的POD活性僅為126.98 μmol/（min·g FW）；此外，POD活性變異系數(shù)達(dá)到28.84%（表1），表明父本、母本和早期多倍體世代間的POD活性存在比較大的差異。差異顯著性分析結(jié)果也表明，二倍體野生種花生父本的POD活性與母本、S0、S1、S2代的POD活性差異顯著；母本的POD活性只與S3代的POD活性差異不顯著，與其他世代差異均顯著。

2.2 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間脯氨酸含量比較

從圖2可以看出，二倍體野生種花生父本植株葉片中的脯氨酸含量為178.46 μg/g，四倍體栽培種花生母本植株葉片中的脯氨酸含量為77.29 μg/g，父本的脯氨酸含量多出母本101.17 μg/g；F1代植株葉片中的脯氨酸含量為217.75 μg/g，分別比母本、父本植株多140.46 μg/g和39.29 μg/g；S0代的脯氨酸含量為218.83 μg/g，S1代的脯氨酸含量為217.86 μg/g，均比F1代植株高出少許；但隨著自交代數(shù)的繼續(xù)增加，植株葉片中的脯氨酸含量不斷降低，到S3代時(shí)，其葉片中的脯氨酸含量僅為95.89 μg/g；植株葉片中的脯氨酸含量變異系數(shù)達(dá)到39.80%（表1），表明種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本植株間的脯氨酸含量存在顯著差異。差異顯著性分析結(jié)果也表明，二倍體野生種花生父本脯氨酸含量與四倍體栽培種花生母本、雜種F1及早期多倍體世代S0～S3代植株葉片中的脯氨酸含量都存在顯著性差異；四倍體栽培種花生母本的脯氨酸含量與S3代差異不顯著，但與其他世代植株中的脯氨酸含量差異顯著；F1代與S0、S1代之間差異不顯著，但與S2、S3代間存在顯著性差異。

2.3 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間丙二醛含量比較

對種間雜種F1、早期異源多倍體世代S0～S3及兩親本植株葉片中的丙二醛含量進(jìn)行比較（圖3），二倍體野生種花生父本植株葉片中的丙二醛含量為0.012 μg/g，四倍體栽培種花生母本的丙二醛含量為0.007 μg/g，父本植株的丙二醛含量高于母本0.005 μg/g；F1代植株葉片的丙二醛含量為0.021 μg/g，分別比母本和父本多0.014 μg/g和0.009 μg/g；S0代和S1植株的丙二醛含量分別為0.018 μg/g和0.016 μg/g，都少于F1代植株，丙二醛含量并沒有隨著染色體加倍而增加，且隨著自交的進(jìn)行，丙二醛含量不斷降低，到S3代時(shí)，其葉片的丙二醛含量僅為0.011 μg/g；各世代及親本植株葉片的丙二醛含量變異系數(shù)達(dá)到33.74%（表1），差異顯著性分析結(jié)果表明，F(xiàn)1代和S0代的丙二醛含量差異不明顯，但兩個(gè)親本的丙二醛含量都與F1代和S0代存在顯著性差異。

2.4 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間可溶性糖含量比較

從圖4可見，二倍體野生種花生父本植株葉片中的可溶性糖含量為11.87 mg/g，四倍體栽培種花生母本植株葉片中的可溶性糖含量為1.42 mg/g，父本的可溶性糖含量比母本多出10.45 mg/g，遠(yuǎn)高于母本；F1代植株葉片中的可溶性糖含量為7.91 mg/g，比母本栽培種高，但低于父本野生種；S0代植株葉片中的可溶性糖含量為8.07 mg/g，S1代植株的可溶性糖含量為8.181 mg/g，均高于F1代；但隨著自交的繼續(xù)進(jìn)行，植株葉片中的可溶性糖含量逐漸降低，到S3代時(shí)，其植株葉片中的可溶性糖含量降為5.34 mg/g，但仍高于栽培種母本；植株葉片中的可溶性糖含量變異系數(shù)高達(dá)44.53%（表1），在所測的生理生化指標(biāo)中變異系數(shù)最大，表明種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本植株間的可溶性糖含量存在顯著差異。顯著性差異分析結(jié)果也表明，母本、父本的可溶性糖含量與雜種F1、早期多倍體世代S0～S3代都存在顯著差異，但雜種F1、早期多倍體世代S0～S3之間差異不顯著。

2.5 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間葉綠素含量比較

圖5的數(shù)據(jù)顯示， 父本野生種植株葉片中的葉綠素含量為32.91 mg/g，母本栽培種植株葉片中的葉綠素含量為33.55 mg/g，父本植株葉片中的葉綠素含量低于母本0.64 mg/g；F1代植株葉片中的葉綠素含量為42.93 mg/g，分別比母本和父本多出9.38 mg/g和10.02 mg/g；S0和S1代植株葉片中的葉綠素含量分別為44.65 mg/g和44.41 mg/g，高于F1植株；但隨著自交的繼續(xù)進(jìn)行，植株葉片中的葉綠素含量也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，到S3代時(shí)，葉綠素含量降至35.51 mg/g；植株葉片中的葉綠素含量變異系數(shù)僅為13.33%（表1），表明雙親及各世代間差異不是很明顯。差異顯著性分析結(jié)果表明，父本與母本之間差異不顯著，父、母本與雜種F1、早期多倍體世代S0～S1代之間差異顯著，但與S2、S3代之間差異不顯著；雜種F1、早期多倍體世代S0～S1代之間差異不顯著，但與S2、S3代差異顯著；S2和S3代之間的葉綠素含量差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

過氧化物酶（POD）是廣泛存在于植物體內(nèi)，能與超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氧酶（CAT）等保護(hù)酶系統(tǒng)協(xié)同將植物體內(nèi)的過氧化氫轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，使膜不易膜脂過氧化，起到保護(hù)膜脂的作用[23]。脯氨酸不僅是生物大分子的保護(hù)劑和羥基的清除劑，還是植物從逆境條件恢復(fù)正常生長過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑，其含量在一定程度上反映了植物的抗逆性[24]?？扇苄蕴遣粌H參與滲透調(diào)節(jié)，還可能參與維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定，調(diào)節(jié)植物組織的生長、發(fā)育和抗逆性等多個(gè)生理生化進(jìn)程[25]。因此，植物體內(nèi)POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量的高低從某種程度上反應(yīng)了植物本身的抗逆性和適應(yīng)環(huán)境的能力。而丙二醛（MDA）被認(rèn)為是逆境脅迫下膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低反映了細(xì)胞膜脂過氧化的水平，可以反應(yīng)植物遭受逆境傷害的程度[26-27]。

本研究結(jié)果表明，父本植株葉片中的POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量均高出母本植株，這與野生種花生比栽培種花生具有更強(qiáng)的抗旱、抗病蟲害和抗連作等特性一致，也在生理特性上證明野生種花生具有更強(qiáng)的抗逆性提供了有效證據(jù)。但父本植株葉片中的丙二醛含量也比母本植株葉片中的高，這可能是因?yàn)橐吧N花生在其進(jìn)化初期，由于生存環(huán)境惡劣造成了體內(nèi)丙二醛的積累并被遺傳保存至今，其含量反映的只是它曾經(jīng)遭受逆境傷害的程度。F1代植株葉片中的POD活性、脯氨酸含量、丙二醛含量和葉綠素含量均高于雙親，這可能與兩個(gè)親本雜交后通過全基因組范圍的等位基因和非等位基因之間相互作用獲得的雜合性和雜種優(yōu)勢有關(guān)，使得雜交所產(chǎn)生的雜種F1代在生活力、適應(yīng)性和競爭能力等方面均超過兩個(gè)親本[28]。S0和S1代植株葉片僅有丙二醛含量低于F1代植株，其余的生理指標(biāo)均高于F1代植株，表明該組合的后代染色體加倍后其多倍體植株具有更強(qiáng)的抗病、抗旱等抗逆能力和環(huán)境適應(yīng)能力，這與普通小麥染色體加倍后適應(yīng)性方面得到極大改良的研究結(jié)果一致[29]。細(xì)胞核內(nèi)染色體組加倍不僅會(huì)帶來細(xì)胞變大等形態(tài)上的變化，多倍體內(nèi)部代謝和生化過程也會(huì)隨之加強(qiáng)[7-9]。

在花生異源多倍體進(jìn)化早期，各個(gè)生理生化指標(biāo)在各世代及親本間表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，其中可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量和POD活性變異系數(shù)都較大，分別達(dá)到了44.53%、39.80%、33.74%和28.84%，這可能是由于在花生異源多倍體進(jìn)化過程中，其基因組及基因表達(dá)模式發(fā)生了廣泛而迅速的變化[17-19]，從而引起生理特性也發(fā)生了劇烈的變化；此外，隨著自交的進(jìn)行，S1到S3代植株葉片所測的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均伴隨著自交代數(shù)的增加而逐漸降低，最終都接近母本栽培種，可能與雜種優(yōu)勢逐漸衰退和偏母性遺傳有關(guān)。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證明了細(xì)胞核內(nèi)染色體組加倍常帶來細(xì)胞變大、抗逆性增強(qiáng)等形態(tài)和生理上的變化，種間雜交引起的雜交和多倍化不僅僅是兩個(gè)基因組融合在一個(gè)細(xì)胞核中，而是包括了一系列分子上和生理上的調(diào)整[10]。這對指導(dǎo)花生屬種間雜交育種利用野生花生優(yōu)異基因及闡明花生異源多倍體進(jìn)化機(jī)制具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 莊 勇， 王述彬. 異源多倍體及其在作物品種遺傳改良中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（26）： 12 498-12 500.

[2] 宋 燦， 劉少軍， 肖 軍， 等. 多倍體生物研究進(jìn)展[J]. 中國科學(xué)C輯（生命科學(xué)）， 2012， 42（3）： 173-184.

[3] 趙旭博， 李愛麗， 毛 龍. 植物多倍化過程中小分子RNA調(diào)控基因表達(dá)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2013， 39（8）： 1 331-1 338.

[4] Jiao Y， Wickett N J， Ayyampalayam S， et al. Ancestral polyploidy in seed plants and angiosperms[J]. Nature， 2011， 473： 97-100.

[5] Feldman M， Levy A A. Genome evolution due to allopolyploidization in wheat[J]. Genetics， 2012， 192： 763-774.

[6] Adams K L， Wendel J F. Polyploidy and genome evolution in plants[J]. Curr Opin Plant Biol， 2005， 8： 135-141.

[7] 雷 春， 陳勁楓， 張曉青， 等. 不同倍性黃瓜的形態(tài)和一些生理生化指標(biāo)比較[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2005， 41（4）： 471-474.

[8] 張夏楠， 高山林. 何首烏同源四倍體的誘導(dǎo)和生理指標(biāo)的測定[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2006， 15（4）： 33-37.

[9] 袁平麗， 劉文革， 路緒強(qiáng)， 等. 不同倍性西瓜果實(shí)發(fā)育過程中番茄紅素含量動(dòng)態(tài)[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2012， 29（5）： 890-894.

[10] 錢春桃， 陳勁楓， 莊飛云. 弱光條件下甜瓜屬種間雜交新種的某些光合特性[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2002， 38（4）： 336-338.

[11] 陳友根， 陳勁楓， 李為觀， 等. 甜瓜屬不同倍性異源多倍體光合特性及超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 33（1）： 32-36.

[12] Kochert G， Halward T， Branchi W D. RFLP variability in peanut（Arachis hypogaea L.）cultivars and wild species[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1991， 81（5）： 565-570.

[13] Gimenes M A， Lopes C R， Valls F M. Genetic relationship among Arachis species based on AFLP[J]. Genetic and Molecular Biology， 2002， 25（3）： 349-353.

[14] Gimenes M A， Lopes C R， Galgaro M L. RFLP analysis of genetic variation in species of section Arachis， genus Arachis （Leguminosae）[J]. Euphytica， 2002， 123： 421-429.

[15] 任小平， 廖伯壽， 黃家權(quán)， 等. 利用SRAP標(biāo)記分析花生屬花生區(qū)組種質(zhì)親緣關(guān)系[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)， 2009， 31（4）： 449-454.

[16] Garcia G M， Tallury S， Kochert G S. Molecular analysis of Arachis interspecific hybrids[J]. Theor Appl Genet， 2006， 112： 1 342-1 348.

[17] 賀梁瓊， 熊發(fā)前， 鐘瑞春， 等. 利用SCoT標(biāo)記分析花生栽培種×A. chacoensis組合異源多倍化的早期基因組變化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（8）： 1 555-1 563.

[18] 賀梁瓊， 熊發(fā)前， 韓柱強(qiáng)， 等. 花生種間雜種異源多倍化早期世代性狀和微衛(wèi)星變化研究[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)， 2013， 35（5）： 499-507.

[19] 賀梁瓊， 熊發(fā)前， 唐秀梅， 等. 花生屬人工異源多倍體進(jìn)化早期基因表達(dá)變化的cDNA-SCoT分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2014， 40（10）： 1 767-1 775.

[20] 唐秀梅， 鐘瑞春， 揭紅科， 等. 間作遮蔭對花生光合作用及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 24（5）： 1 703-1 707.

[21] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000： 195-196.

[22] 陳建勛， 王曉峰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 廣州： 華南理工大學(xué)出版社， 2002： 124-125.

[23] 林碧英， 張 瑜， 林義章. 不同光質(zhì)對豇豆幼苗光合特性和若干生理生化指標(biāo)的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2002， 38（4）： 417-422.

[24] 武永軍， 曹 讓， 王愛連， 等. 不同pH緩沖液處理下蠶豆幼苗葉片SOD、 POD和CAT活性的變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2009， 18（6）： 170-173.

[25] 趙江濤， 李曉峰， 李 航， 等. 可溶性糖在高等植物代謝調(diào)節(jié)中的生理作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 34（24）： 6 423-6 425， 6 427.

[26] Apel K， Hirt H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review Plant Biology， 2004， 55： 373-399.

[27] 丁玉梅， 馬龍海， 周曉罡， 等. 干旱脅迫下馬鈴薯葉片脯氨酸、丙二醛含量變化及與耐旱性的相關(guān)性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 26（1）： 106-110.

[28] 桂 琴， 徐延浩， 王建波. 多倍體植物中基因表達(dá)模式的變化[J]. 武漢植物學(xué)研究， 2007， 25（2）： 198-202.

[29] Mestiri I， Chague V， Tanguy A M， et al. Newly synthesized wheat allohexaploids display progenitor-dependent meiotic stability and aneuploidy but structural genomic additivity[J]. New Phytology， 2010， 186： 86-101.