曹青鋒 閆舒雅 龍佳寶 孟祥賢

摘 要：DNA邏輯門在分子計算機和分子水平上的計算技術中具有重要作用。我們通過設計核酸適體與凝血酶特異結合導致膠體金團聚的方法，構建了凝血酶的DNA邏輯門。凝血酶作為輸入信號與其核酸適體結合，將監(jiān)測探針上的膠體金結合位點釋放，兩個核酸功能化修飾的膠體金同時結合到監(jiān)測探針上，引起膠體金團聚，實現(xiàn)信號輸出。根據(jù)這個設計原理，成功構建了蛋白質(zhì)凝血酶的YES邏輯門。關鍵詞：DNA邏輯門；凝血酶：膠體金：核酸適體

中圖分類號：Q955 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）03-0210-03

以核酸為基礎的分子計算機或者分子水平上的信息處理有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的以硅作為原件的計算機技術，在生物醫(yī)學領域具有重要意義[1-6]。這是因為核酸與以硅為基礎的生物運算相比具有結構簡單、能和其互補鏈雜交，以及能與目標分子f金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)）相互作用的特點，在構建DNA計算機方面有巨大優(yōu)勢。設計并構建DNA邏輯門引起了國內(nèi)外廣大研究者的興趣[7～13]。如：汪爾康院士利用核酸置換技術和G四聚體組裝技術構建邏輯門，在體外模擬控制光敏劑PPIX的釋放[8]；Song等采用兩個DNA origami納米結構構建用于microRNA檢測的邏輯門[9]；Xu等利用連接酶形成環(huán)形DNA分子構建邏輯門[10]；Winner等構建了一個基于離子的DNAzyme邏輯門實現(xiàn)U022+的靈敏檢測等等[11]。

在本文中，我們利用核酸適體和膠體金技術構建了一種新型的DNA邏輯門，用于蛋白質(zhì)凝血酶分析。核酸適體是經(jīng)體外篩選技術SELEX（指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化）篩選出的能特異結合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。它是一系列單鏈核酸分子，與特異靶分子相結合，特異性如同抗體一樣，對可結合的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力。核酸適體在生物傳感器、新藥開發(fā)以及納米技術等方面有著廠一泛的用途[14]。本文選用凝血酶蛋白質(zhì)作為邏輯門的輸入，利用凝血酶與其核酸適體特異結合，釋放出監(jiān)測探針上的膠體金結合位點，引起膠體金團聚，實現(xiàn)邏輯門信號輸出，實現(xiàn)凝血酶分析。

1試驗方法

1.1試劑與儀器

試劑：本文中所用寡核苷酸由大連寶生物公司合成。Nl：CTT CTT GGC AGT CCG TGG TAGGGC AGG TGG GGG TGA CT； N2：GCC AAG AAGGGG GAC TGC CAA GAA G：N3： SH - TTTT CT-TCTTGGC。Nl是凝血酶核酸適體序列；N2是監(jiān)測探針序列；N3序列在5 7端修飾有巰基。HAu-Cl4、BSA、HSA、IgG，檸檬酸三鈉購自上海生工生物有限公司，凝血酶購自北京鼎國生物有限公司，所用其他化學試劑均為分析純。儀器：紫外可見分光光度計（UV 1750日本島津）。

1.2 實驗方法

1 .2.1 膠體金的制備

該方法采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。首先將100 ml_， O.O1%的HALiCl4溶液在加熱攪拌器上攪拌加熱至沸騰，迅速加入4.5 mL l%的檸檬酸三鈉水溶液并繼續(xù)攪拌加熱。煮沸7～10min，最后定格為透明酒紅色。室溫冷卻，封存于4 °C的冰箱中。

1.2.2膠體金的核酸功能化修飾

首先將制得的金溶膠濃縮1倍，于1mL濃縮的納米金中緩慢加入N3溶液，室溫放置16 h后逐滴加入100 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4），隨后加入2 mol/L NaCl進行老化。離心分離，最后將沉積物分散于10 mmol/L PBS中，4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紫外吸收光譜的測定

配制底液：20 mmol/L Tris-HCl （pH=7.4），2 mmol/L MgCl2。在底液中加入10 nmol/L凝血酶和100 nmol/L Nl，孵育30 min，再加入100 nmol/LN2和N3，孵育5 min后在紫外可見分光光度計上進行測定。特異性實驗過程和凝血酶實驗過程一樣，只是用其他蛋白（BSA、HSA、IgG）代替凝血酶。以上反應溫度為室溫。

2 結果與分析

通過二進制“1-0”概念設計的可進行特殊運算的邏輯門，有一個輸入便有一個輸出結果。“YES”門是當輸人為1時輸出也為1。我們把蛋白質(zhì)凝血酶作為輸入信號，膠體金團聚信息作為輸出信號，利用凝血酶與其核酸適體特異相互作用導致膠體金團聚的原理，構建了YES邏輯門。示意圖見圖1。邏輯門由鏈Nl、N2和N3組成。Nl是核酸適體序列，由兩部分組成，一部分是凝血酶的核酸適體序列，另一部分能與N2互補，封閉膠體金結合位點；N3是核酸功能化修飾的膠體金（Au-DNA）；N2是監(jiān)測探針序列，有兩個相同的Au-DNA結合位點。當N2監(jiān)測探針上的兩個Au-DNA結合位點同時與Au-DNA結合時，膠體金團聚，引起膠體金吸收峰值下降，甚至吸收峰紅移；但是當沒有凝血酶輸入時，核酸適體與監(jiān)測探針結合，封閉膠體金結合位點，則不能引起膠體金團聚，沒有吸收峰值下降或吸收峰紅移現(xiàn)象，從而沒有信號輸出。

從圖1可以看出，作為邏輯門信號輸出方式的功能化膠體金對邏輯門構建具有重要意義。我們首先檢測了核酸功能化修飾的膠體金（圖2）。我們發(fā)現(xiàn)新制備的膠體金在522 nm有一個明顯的吸收峰，但是加入鈉離子后，吸收峰發(fā)生明顯的紅移，且522 nm處吸收明顯下降（圖2A）；但是當膠體金用核酸進行功能化修飾后，加入鈉離子，我們發(fā)現(xiàn)吸收峰沒有明顯的偏移，同時522 nm處的吸收值沒有顯著變化。這些結果說明膠體金進行了很好的核酸功能化，即使加入較高濃度的鹽條件下仍然能保持良好的分散性能，能夠很好地用于邏輯門構建。

YES門是邏輯門中最簡單的門之一。當有輸入信號時，就有輸出信號產(chǎn)生。在圖3中，發(fā)現(xiàn)輸入凝血酶，在522 nm的吸收值發(fā)生明顯下降，吸收峰明顯紅移；而沒有凝血酶時，在522 nm有一個明顯的吸收峰。這是因為凝血酶與核酸適體結合，將探針上膠體金結合位點釋放，加入核酸功能化修飾的膠體金，兩個膠體金同時結合到探針上，導致膠體金團聚，輸出信號；當沒有凝血酶輸入時，不能有效釋放膠體金結合位點，功能化膠體金不能同時結合到探針上，則不能輸出信號。上述結果證明我們有效地構建了以凝血酶為輸入信號，以膠體金團聚為輸出信號的YES邏輯門。

最后我們探索了新研制的DNA邏輯門的特異性。這是因為作為分子計算機基礎的DNA邏輯門為實現(xiàn)疾病的診治及預后，必須具有好的特異性[3-5]。我們用非凝血酶蛋白質(zhì)（BSA、HSA、IgG）對邏輯門的特異性進行了研究。結果顯示在圖4中。我們發(fā)現(xiàn)當輸入BSA、HSA、IgG等蛋白質(zhì)時，吸收峰及吸收值都沒有明顯變化，但是當輸入凝血酶蛋白質(zhì)時，522 nm吸收峰明顯降低，峰出現(xiàn)明顯紅移。這些實驗說明邏輯門具有好的特異性。

3討論

我們根據(jù)核酸適體和蛋白質(zhì)特異性結合，引起功能化膠體金團聚的特性，構建了凝血酶輸入信號的YES邏輯門，快速監(jiān)測凝血酶在樣品中的存在。當我們將凝血酶的核酸適體設計為其他蛋白質(zhì)或小分子的核酸適體時，依據(jù)該邏輯門構建方法，我們可以構建其他蛋白質(zhì)或小分子的邏輯門，從而實現(xiàn)更多蛋白質(zhì)等物質(zhì)的監(jiān)測，在臨床上為疾病的防治將有重要的作用。