胡莉萍

摘 ?要：首先取11日齡青腳黃羽肉雞150只分為5組，每組30只，分別為給予1%、0.8%、0.6%、0.4%濃度的增免肽顆?；祜?個(gè)給藥組和1個(gè)空白對(duì)照組，經(jīng)連續(xù)給藥7d、觀察14d的藥物耐受性試驗(yàn)證實(shí)，增免肽顆粒以1%濃度下連續(xù)對(duì)雛雞無(wú)不良反應(yīng)和毒性作用，且0.4%以下濃度混飲有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。再取462只11日齡雛雞，隨機(jī)分為7組?？瞻讓?duì)照組30只隔離飼養(yǎng)，不做任何處理。其余6組每組72只，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24只;次日3個(gè)藥物劑量組開始混飲高、中、低劑量的增免肽顆粒，藥物對(duì)照組混飲鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖粉，連續(xù)5d，疫苗對(duì)照組和攻毒對(duì)照組不給藥;14日齡各組用ND-La Sota苗滴鼻點(diǎn)眼免疫;26日齡重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d，28日齡重復(fù)免疫;40日齡重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d，42日齡除疫苗對(duì)照組外各組均用新城疫強(qiáng)毒攻毒。分別于21、28、35、42日齡每組隨機(jī)抽取12只頸靜脈采血，分離血清，用血凝抑制法測(cè)定新城疫抗體效價(jià);于21、35、42日齡每組隨機(jī)抽取6只，采血分離外周血淋巴細(xì)胞，用MTT法測(cè)定其增殖;于21和42日齡每組隨機(jī)抽取6只稱重、撲殺，測(cè)免疫器官指數(shù);攻毒后每天觀察14d內(nèi)各組發(fā)病和死亡情況，計(jì)算發(fā)病率、死亡率和免疫保護(hù)率;于21、42、56日齡統(tǒng)計(jì)攻毒前后的平均日增重、耗料量和料重比。結(jié)果表明，增免肽顆粒顯著提高血清抗體效價(jià)，促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增殖，提高免疫器官指數(shù)和攻毒保護(hù)率，并能提高增重和降低料重比。高、中劑量組效果較好，明顯優(yōu)于鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖，兩組之間多無(wú)顯著差異，建議中劑量（按0.2%混飲）為臨床應(yīng)用劑量。

關(guān)鍵詞：增免肽顆粒;藥物耐受;雞新城疫;免疫效果;免疫保護(hù)

中圖分類號(hào)：S858.312.4 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）03-0043-05

增免肽顆粒主要成分為黃芪、白術(shù)等純中藥成分，有補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表功能，主要用于免疫功能低下、免疫抑制等。依據(jù)有關(guān)臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則，我們對(duì)增免肽顆粒進(jìn)行了耐受性試驗(yàn)和增強(qiáng)免疫效果試驗(yàn)。

1 ?材料與方法

1.1 ?藥物、試劑和儀器 ?受試藥物增免肽顆粒，每1ml含生藥1g，批號(hào)：2014020402。由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)用生物制藥實(shí)驗(yàn)室提供。

對(duì)照藥物：鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖可溶性粉，每出口袋100g，含鹽酸左旋咪唑5g、黃芪多糖8g，批號(hào)：20140114。湖南湘大獸藥有限公司出品。

疫苗和病毒：雞新城疫低毒力活疫苗（La Sota株），批號(hào)：20140104。武漢中博生物科技股份有限公司出品。新城疫強(qiáng)毒株（NDV-F48E8）、新城疫抗體效價(jià)測(cè)定（血凝抑制法）抗原SPF雞胚NDV-La Sota尿囊液、新城疫抗體陽(yáng)性血清，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。其中NDV-F48E8種毒用10日齡SPF雞胚增殖，經(jīng)Reed-Muench法測(cè)定其EID50為10-7.97，臨用前用PBS稀釋成104、105、106、107EID50。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，分析天平等。

1.2 ?動(dòng)物 ?1日齡青腳黃羽肉雞，購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。試驗(yàn)前按常規(guī)飼養(yǎng)，喂不含任何藥物的全價(jià)飼料，自由采食及飲水，飼養(yǎng)至11日齡用于試驗(yàn)。

1.3 ?方法

1.3.1 ?藥物耐受性試驗(yàn) ?選150只11日齡臨床健康的雛雞，公母兼有，稱重，按體重（兼顧公母）隨機(jī)分成5組，參照中華人民共和國(guó)獸藥典[1]和大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果[2]，其中4個(gè)給藥組分別按1%、0.8%、0.6%、0.4%的增免肽顆?；祜嬤B續(xù)給藥7d，1個(gè)空白對(duì)照組則不給藥。每天觀察1次，仔細(xì)記錄動(dòng)物的采食、飲水、排便和毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間、死亡情況，連續(xù)觀察14d。觀察期內(nèi)動(dòng)物自由采食和飲水。觀察期結(jié)束后分別稱重，統(tǒng)計(jì)各組的日均增重、日均采食量和料重比，最后處死所有存活雞，進(jìn)行眼觀病理學(xué)檢查。

1.3.2 ?增強(qiáng)免疫效果試驗(yàn) ?同上選462只11日齡臨床健康的雛雞，隨機(jī)分為7組?？瞻讓?duì)照組30只隔離飼養(yǎng)，不做任何處理。其余6組每組72只，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24只，疫苗對(duì)照組和攻毒對(duì)照組各加24只用于攻毒劑量測(cè)定;次日起3個(gè)藥物劑量組開始混飲高、中、低劑量的增免肽顆粒，藥物對(duì)照組混飲鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖粉，連續(xù)5d，疫苗對(duì)照組和攻毒對(duì)照組不給藥;14日齡時(shí)（測(cè)得母源抗體效價(jià)為2.8±0.3log2）各組均用新城疫La Sota苗滴鼻點(diǎn)眼免疫，2羽份/只;26日齡開始重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d;28日齡時(shí)重復(fù)免疫;40日齡開始重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d;42日齡時(shí)除疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組外各組用新城疫強(qiáng)毒F48E8攻毒。具體分組與處理（藥物濃度參照耐受性試驗(yàn)結(jié)果確定）如表1。

1.3.3新城疫抗體效價(jià)測(cè)定 ?分別于21、28、35、42日齡時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)藥物組、藥物對(duì)照組和疫苗對(duì)照組每組隨機(jī)抽取12只，頸靜脈采血，分離血清，用血凝抑制法[3]測(cè)定新城疫抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。首先測(cè)抗原血凝價(jià)（HA），主要步驟為：在96孔“V”形微量反應(yīng)板上，用生理鹽水50μl/孔自左向右將NDV-La Sota尿囊液抗原病毒作2倍比稀釋至第11孔（21～211），第12孔為生理鹽水對(duì)照孔，向各孔加入1%雞紅血球50μl，振蕩混勻1min，37℃靜置作用20min左右觀察結(jié)果，以100%凝集（紅血球呈顆粒性傘狀凝集沉于孔底）的病毒最大稀釋孔為該病毒血凝價(jià)（即1個(gè)凝集單位）。實(shí)測(cè)的NDV-La Sota尿囊液抗原病毒的凝集價(jià)為1：29。其次用4單位（1：27即128倍稀釋的尿囊液）病毒測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血清中新城疫抗體的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)（HI），主要步驟為：在96孔“V”形微量反應(yīng)板上，用生理鹽水50μl/孔自左向右將50μl/孔待檢血清作2倍比稀釋至第10孔（21～210），第11孔為病毒對(duì)照，第12孔陽(yáng)性血清對(duì)照，1～11孔加入4單位病毒50μl/孔，振蕩混勻1min，置37℃溫箱作用20min，再加入1%雞紅血球50μl/孔，再振蕩混勻1min，37℃靜置作用20min左右觀察結(jié)果，以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度（即抗體效價(jià)），用-log2表示。

1.3.4 ?外周血淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定 ?分別于21、35、42日齡時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)藥物組、藥物對(duì)照組和疫苗對(duì)照組每組隨機(jī)抽取6只（設(shè)3個(gè)重復(fù)），每只頸靜脈無(wú)菌采血（肝素抗凝）1.5ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，采用MTT法[4，5，6]測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖。

1.3.5 ?免疫保護(hù)效果測(cè)定

1.3.5.1 ?攻毒劑量預(yù)試 ?另取分別于14日齡和28日齡經(jīng)新城疫La Sota苗滴鼻點(diǎn)眼，2羽份/只，2次免疫的32日齡雛雞96只，隨機(jī)均分為4組，每組24只，分別用104、105、106、107 EID50的NDV-F48E8 0.2ml經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼攻毒，之后每天觀察1次，仔細(xì)記錄每組的發(fā)病及死亡情況，觀察10d，統(tǒng)計(jì)各組死亡率，作為攻毒劑量依據(jù)。

1.3.5.2 ?攻毒試驗(yàn) ?42日齡時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)藥物組、藥物對(duì)照組和攻毒對(duì)照組每組取12只（設(shè)3個(gè)重復(fù)），每羽經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼106EID50的NDV-F48E8 0.2ml攻毒（參照上述攻毒劑量測(cè)試結(jié)果）。每天觀察各組雞的發(fā)病和死亡情況，死亡雞剖檢觀察病理變化，連續(xù)觀察14d，計(jì)算各組的發(fā)病率、死亡率和免疫保護(hù)率。免疫保護(hù)率=存活健康雞數(shù)/樣本數(shù)。

1.3.6 ?免疫器官指數(shù)測(cè)定 ?于21和42日齡時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)藥物組、藥物對(duì)照組和疫苗對(duì)照組每組隨機(jī)抽取6只稱重，撲殺，分離胸腺、脾臟和法氏囊、稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官（g）/體重（g）。

1.3.7 ?生長(zhǎng)性能測(cè)定

1.3.7.1 ?日均增重 ?分別于14、21、42、56日齡時(shí)，各組稱重，分別計(jì)算14～21、22～42、43～56日齡3個(gè)時(shí)間段的日均增重。日均增重（g/d/羽）=（平均末重-平均始重）/飼喂天數(shù)。

1.3.7.2 ?日均采食量 ?分別計(jì)算14～21、22～42、43～56日齡3個(gè)時(shí)間段的耗料量，計(jì)算日均采食量。日均采食量（g/d/羽）=耗料量/飼喂天數(shù)/羽。

1.3.7.3 ?料重比 ?分別計(jì)算各組3個(gè)時(shí)間段的總耗料量和總增重，計(jì)算料重比。料重比（g/g）=總耗料/總增重。

1.3.8 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) ?數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件比較各組抗體效價(jià)、淋巴細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)性能的差異，用卡方檢驗(yàn)[7]比較各組發(fā)病率、死亡率、保護(hù)率的差異。

2 ?結(jié)果

2.1 ?藥物耐受性 ?4個(gè)給藥組分別按1%、0.8%、0.6%、0.4%的增免肽顆?；祜嬤B續(xù)給藥7d，觀察至14d。觀察期內(nèi)各用藥組和空白對(duì)照組所有雛雞采食、飲水、排便等均正常，未出現(xiàn)不良反應(yīng)及死亡。觀察期結(jié)束后分別稱重，處死存活雛雞，眼觀病理學(xué)檢查心、肝、腎、肺、腺胃、肌胃及腸道等組織器官，均未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化;各組日均增重、日均采食量和料重比統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，0.4%和0.6%增免肽顆粒混飲組日均增重略高，0.4%組的料重比略小，但經(jīng)卡方檢驗(yàn)沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），詳細(xì)結(jié)果見表2。因日均采食量為組內(nèi)平均值，故未作顯著性統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 ?抗體效價(jià)變化 ?21日齡（21d，首免后第7天）時(shí)，3個(gè)增免肽顆粒組和陽(yáng)性藥物組的抗體效價(jià)顯著高于疫苗對(duì)照組（P<0.05）;28d時(shí)，3個(gè)增免肽顆粒組的抗體效價(jià)最高，顯著高于藥物對(duì)照和疫苗對(duì)照組（P<0.05），而后兩組之間亦有顯著差異（P <0.05）;35d和42d時(shí)，增免肽顆粒高、中劑量組的抗體效價(jià)顯著高于其余3組（P<0.05），而低劑量組和藥物對(duì)照組則顯著高于疫苗對(duì)照組（P<0.05）;由于空白對(duì)照組沒(méi)有免疫，其沒(méi)得的抗體效價(jià)是殘留的母源抗體，故不與其他各組作統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析;這階段攻毒對(duì)照組與疫苗對(duì)照組處理完全一樣，測(cè)得結(jié)果基本一致，故亦不再列出統(tǒng)計(jì)分析。詳細(xì)結(jié)果見表3。

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2.3 ?淋巴細(xì)胞增殖的變化 ?21d（首免后第7天）時(shí)，增免肽顆粒高、中劑量組和藥物對(duì)照組的A570值顯著高于其余2組（P<0.05），3組間無(wú)顯著差異（P>0.05），而增免肽顆粒低劑量組又顯著高于疫苗對(duì)照組（P<0.05）;35d和42d時(shí)，增免肽顆粒高、中劑量組的A570值顯著高于低劑量組和藥物對(duì)照組（P<0.05），后2組與疫苗組間亦存在顯著差異（P<0.05）;與空白對(duì)照組相比，所有其他試驗(yàn)組各時(shí)間的淋巴細(xì)胞增殖都顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），表明新城疫La Sota苗的免疫對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用。詳細(xì)結(jié)果見表4。

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2.4 ?免疫保護(hù)效果 ?32日齡雛雞的攻毒后經(jīng)10d觀察發(fā)現(xiàn)：107EID50劑量組于攻毒后第4天開始發(fā)病，第5天出現(xiàn)死亡，最終死亡率為20.8%;106EID50劑量組于攻毒后第5天發(fā)病、出現(xiàn)死亡，最終死亡率為12.5%;105EID50劑量組于攻毒后第7天發(fā)病，第8天出現(xiàn)死亡，最終死亡率為4.17%;104EID50劑量組未見發(fā)病。因此選擇106EID50的NDV-F48E8 0.2ml為攻毒劑量。各計(jì)劃攻毒組于42日齡經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼攻毒后，除增免肽顆粒高、中劑量組外，其余3組雞于攻毒后第5天（D5）開始零星出現(xiàn)綠色稀便、精神、飲食下降等發(fā)病癥狀，到第7天時(shí)攻毒對(duì)照組已死亡1只，各組雞的具體發(fā)病時(shí)間、數(shù)量和死亡時(shí)間、數(shù)量詳見表5。

死亡雞剖檢，可見新城疫病理變化，如口腔、嗉囊有粘液，鼻孔有干酪樣鼻液，氣管內(nèi)有粘性分泌物、黏膜充血出血，腺胃乳頭及腸粘膜出血。

至第13天時(shí)所有存活雞全部恢復(fù)健康。增免肽顆粒高、中劑量組的免疫保護(hù)率達(dá)100%，顯著高于其余3組（P<0.05），而增免肽顆粒低劑量組的94.4%，略高于藥物對(duì)照組的91.7%（P>0.05），明顯高于攻毒對(duì)照組的89.9%（P<0.05），見表5。

2.5 ?免疫器官指數(shù) ?21日齡（21d）時(shí)，增免肽顆粒3個(gè)劑量組和藥物對(duì)照組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著高于疫苗對(duì)照和空白對(duì)照組（P<0.05），增免肽顆粒3個(gè)劑量組的法氏囊指數(shù)均高于其余3組，但無(wú)顯著性差異;42d時(shí)，增免肽顆粒3個(gè)劑量組的法氏囊指數(shù)均顯著高于其余3組（P<0.05），中劑量組的脾臟指數(shù)雖明顯高于其余各組，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。因攻毒對(duì)照組與疫苗對(duì)照組處理完全一樣，故沒(méi)列出統(tǒng)計(jì)分析。詳細(xì)結(jié)果見表6。

2.6 ?生長(zhǎng)性能的變化 ?在攻毒前（14～42d），除增免肽顆粒高、中劑量組14～21d時(shí)的料重比明顯小于各組（P<0.05）外，其余各的日均增重、日均采食量和料重比無(wú)顯著差異（P>0.05）。但攻毒后（43～56d），增免肽顆粒高、中劑量組的日均增料重比與其余3個(gè)攻毒組有差異顯著（P<0.05），而與沒(méi)攻毒的疫苗對(duì)照組、空白對(duì)照組之間卻沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。詳細(xì)結(jié)果見表7。

3 ?討論

藥物耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明，增免肽顆粒1%以下濃度連續(xù)混飲7d，對(duì)雛雞無(wú)不良反應(yīng)和毒性作用，且0.4%以下有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。

增強(qiáng)免疫效果試驗(yàn)結(jié)果顯示，首先增免肽顆粒高、中劑量組的抗體效價(jià)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率迅速上升，各觀察時(shí)間點(diǎn)的抗體效價(jià)、淋巴細(xì)胞增殖和攻毒保護(hù)率最高，明顯高于其余各組（P<0.05），增免肽顆粒低劑量組和藥物對(duì)照組亦顯著高于疫苗對(duì)照或攻毒對(duì)照組;其次增免肽顆粒能顯著增加21日齡前胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和21～42日齡的法氏囊指數(shù)。表明增免肽顆?？梢悦黠@提高新城疫苗的免疫應(yīng)答。同時(shí)也有一定的促進(jìn)增重和降低料重比作用，以高、中劑量效果最好，與疫苗對(duì)照無(wú)顯著差異;其次是低劑量組和藥物對(duì)照組則明顯優(yōu)于攻毒對(duì)照組。因此，鑒于高、中劑量之間多無(wú)顯著差異，建議中劑量作為臨床應(yīng)用劑量。

4 ?結(jié)論

增免肽顆粒以1%濃度下連續(xù)對(duì)雛雞無(wú)不良反應(yīng)和毒性作用，且0.4%以下濃度混飲有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。

增免肽顆粒具有明顯的增強(qiáng)免疫作用，推薦中劑量（按0.2%混飲）為臨床應(yīng)用劑量。

（參考文獻(xiàn)略）