王波　崔翠　顧穎慧

摘 要 以鐵皮石斛莖尖為外植體進(jìn)行高效再生體系建立實(shí)驗(yàn)，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素濃度的配比、天然添加物對(duì)原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化的影響，篩選出適合各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)體系配方，建立鐵皮石斛組織培養(yǎng)快速繁殖體系

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；原球莖誘導(dǎo)；快繁體系

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2015）18-00-03

鐵皮石斛（Dendrobium candidum），又稱黑節(jié)草，云南鐵皮，蘭科多年生附生草本植物，道家養(yǎng)生經(jīng)典著作《道臧》譽(yù)其為“中華九大仙草之首” [1]。由于人們對(duì)野生鐵皮石斛的過度采挖，使得其野生資源已瀕臨滅絕，而鐵皮石斛的種子極小且無胚乳，自然條件下萌發(fā)率極低，實(shí)生苗人工栽培相對(duì)比較困難；并且傳統(tǒng)的分株、扦插等繁殖方式生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，繁殖率低，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上的需要[2]。為此，開展鐵皮石斛的組織培養(yǎng)研究成為必然。目前，有關(guān)鐵皮石斛組織培養(yǎng)成功的報(bào)道很多[3]。在鐵皮石斛再生體系技術(shù)研究中，原球莖誘導(dǎo)是整個(gè)再生的體系中開始的環(huán)節(jié)，其誘導(dǎo)率的高低直接影響瓶苗的出苗率、生產(chǎn)成本。本研究以鐵皮石斛無菌苗作為外植體，對(duì)莖尖誘導(dǎo)原球莖的增殖和分化進(jìn)行系統(tǒng)研究，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素的濃度配比和天然添加物為因子，采用正交試驗(yàn)篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方，以期縮短組培苗生長(zhǎng)周期、提高組培苗質(zhì)量和移栽成活率，為人工規(guī)?；敝澈驮耘嗵峁┘夹g(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選用濰坊工程職業(yè)學(xué)院花卉研究所培育的鐵皮石斛無菌苗作為組織培養(yǎng)的外植體材料

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取健壯無污染的組培苗，在解剖鏡下仔細(xì)剝離莖尖，逐層剝?nèi)ネ鈬M織，用解剖刀切取0.1～0.2 mm的莖尖，分別接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)，外植體膨大產(chǎn)生原球莖。將產(chǎn)生的原球莖轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，經(jīng)原球莖的增殖和分化形成新的植株。人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，濕度為75%，光照強(qiáng)度為2 000 lx，時(shí)間12 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖的誘導(dǎo)

以莖尖為外植體誘導(dǎo)原球莖的發(fā)生階段做三因素三水平正交試驗(yàn)（表1），將切取的莖尖接種到不同配方的培養(yǎng)基中，每瓶接種4個(gè)莖尖，每個(gè)處理接種5瓶，重復(fù)3次?；九囵B(yǎng)基：MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。培養(yǎng)期間定期觀察原球莖誘導(dǎo)情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。對(duì)照不加激素和天然添加物，試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），在不添加激素和天然添加物時(shí)，外植體的誘導(dǎo)率為13.3%，當(dāng)添加不同濃度的激素和天然添加物后原球莖的誘導(dǎo)率均有所上升。并且極差分析表明在所設(shè)置的3個(gè)因素中6-BA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響比較明顯，其次為天然添加物椰肉和NAA。綜合分析極差結(jié)果，該試驗(yàn)最佳培養(yǎng)基配比為：MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

因素

水平 A B C

NAA/（mg/L） 6-BA//（mg/L） 椰肉/（g/L）

1 0.1 0.2 5

2 0.2 0.5 10

3 0.5 1.0 15

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析

試驗(yàn)號(hào) A B C 誘導(dǎo)率/%

CK 0 0 0 13.3

1 1 1 1 31.7

2 1 2 2 41.7

3 1 3 3 35.0

4 2 1 3 31.7

5 2 2 1 43.3

6 2 3 2 38.3

7 3 1 2 31.7

8 3 2 3 35.0

9 3 3 1 35.0

K1 108.4 95.1 110 -

K2 113.3 120 116.7 -

K3 101.7 108.3 91.7 -

k1 36.1 31.7 36.7 -

k2 37.8 40.0 38.9 -

k3 33.9 36.1 33.9 -

R 3.9 8.3 5.0 -

2.2 原球莖的增殖

將上述試驗(yàn)中相同條件下生長(zhǎng)良好的原球莖，切割成直徑約1.0 cm×1.0 cm小塊接種到不同激素和天然添加物配比的培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊，60 d內(nèi)統(tǒng)計(jì)原球莖的增殖情況?；九囵B(yǎng)基。1/2MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。以NAA、6-BA、KT、椰乳為因素設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)（表3）。

原球莖培養(yǎng)7 d后，增殖現(xiàn)象開始明顯，新增原球莖淡黃綠色；30 d原球莖增殖加快；60 d后部分原球莖少部分出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。9 組試驗(yàn)原球莖增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)狀況都出現(xiàn)差異（表4），試驗(yàn)組5號(hào)、6號(hào)、9號(hào)原球莖生長(zhǎng)緊致，顏色綠色，增殖倍數(shù)較大；試驗(yàn)組1號(hào)、4號(hào)和7號(hào)原球莖的增殖倍數(shù)較低，生長(zhǎng)后期出現(xiàn)黃化壞死現(xiàn)象。極差分析結(jié)果表明NAA、6-BA、KT、椰乳四個(gè)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響順序?yàn)?-BA>NAA>KT>椰乳，最適實(shí)驗(yàn)組合為B2A2C2D3。綜合原球莖增殖倍數(shù)及生長(zhǎng)狀況，增殖最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

表3 不同激素和天然添加物因素水平表

因素

水平 A B C D

NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 椰乳/（g/L）

1 0.2 1.0 0 5

2 0.5 1.5 0.5 10

3 1.0 2.0 1.0 15

2.3 原球莖的分化

將上述增殖試驗(yàn)中生長(zhǎng)一致且狀態(tài)健壯的原球莖，切割成直徑約1.0 cm×1.0 cm小塊接種到不同激素和天然添加物配比的分化培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊，每種處理接5瓶，30 d統(tǒng)計(jì)原球莖的分化情況?；九囵B(yǎng)基：MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。以NAA、6-BA、KT、馬鈴薯提取物為測(cè)試因素設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)（表5）。在設(shè)置的9組試驗(yàn)中原球莖的分化出現(xiàn)了明顯的差異（表6），試驗(yàn)組5號(hào)、6號(hào)原球莖分化率最大； 試驗(yàn)組1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)分化率較低。極差分析結(jié)果表明NAA、6-BA、KT、馬鈴薯提取物四個(gè)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響順序?yàn)镹AA>6-BA>KT>馬鈴薯提取物，最適實(shí)驗(yàn)組合為A2B1C2D3。原球莖最適分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

表5 原球莖分化培養(yǎng)基因素水平表

因素

水平 A B C D

NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 馬鈴薯提取物/（g/L）

1 0.5 1.0 0 50

2 1.0 1.5 0.1 100

3 1.5 2.0 0.5 150

（上接第頁）

3 結(jié)論

自然狀態(tài)下，鐵皮石斛的種子極小，繁殖率低，用組織培養(yǎng)方法快速繁殖大量試管苗，是解決種苗最有效的途徑之一[4]。本研究綜合各試驗(yàn)階段初步建立了一套較完整的鐵皮石斛組織培養(yǎng)繁殖體系。以莖尖為外植體分別研究了不同激素配比和天然添加物對(duì)鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)、增殖和分化的影響。從中比較和篩選出適合不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，莖尖誘導(dǎo)原球莖的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，原球莖增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。原球莖分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。在本試驗(yàn)體系中原球莖的分化率最大可以達(dá)到93.3%，這為鐵皮石斛規(guī)?；a(chǎn)提供了更加有力的保障。

參考文獻(xiàn)

[1][魏]吳普，等述.神農(nóng)本草經(jīng)[M].[清]孫星衍，等輯.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：21.

[2]徐路加，華允芬.石斛原球莖的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].北方園藝，2014（6）.

[3]王麗萍，梁淑云.鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)與增殖研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010（1）.

[4]張啟香，付素靜，方炎明，等.鐵皮石斛擬原球莖的發(fā)生過程[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（3）.

（責(zé)任編輯：劉昀）