魏占勇，劉欣，魏麗娟，耿智霞?，張櫻，宋婷婷，賈興，連麗娟，夏曦

（1.河北遠征藥業(yè)有限公司，石家莊050041；2.中國農(nóng)業(yè)大學，北京100083）

硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑在奶牛乳汁中的殘留消除研究

魏占勇1，劉欣1，魏麗娟1，耿智霞1?，張櫻1，宋婷婷1，賈興1，連麗娟1，夏曦2

（1.河北遠征藥業(yè)有限公司，石家莊050041；2.中國農(nóng)業(yè)大學，北京100083）

建立了牛奶中硫酸頭孢喹肟殘留超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法（UPLC-MS／MS）。選取18頭剛進入干乳期的健康奶牛，隨機分為6個組，分別于預產(chǎn)期前的42、35、28、21、14和7 d進行乳房注入硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（3 g∶150 mg／支），只用藥一次，產(chǎn)犢后采集奶樣。結(jié)果表明：預產(chǎn)期前7 d給藥，奶牛產(chǎn)犢72 h后采集的奶樣中頭孢喹肟殘留量降至MRL（20 μg／kg）附近；預產(chǎn)期前14 d和21 d給藥，奶牛產(chǎn)犢12 h后采集的奶樣中頭孢喹肟殘留量降至MRL以下，均低于檢測限；預產(chǎn)期前28、35和42 d給藥，所有采集奶樣的頭孢喹肟殘留量均低于檢測限。建議在預產(chǎn)期前7、14和21 d給藥硫酸頭孢喹肟乳房注入劑的棄奶期分別為產(chǎn)犢后5、1和0 d。

頭孢喹肟；牛奶；殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

頭孢喹肟（Cefquinome）是目前第四代頭孢菌素中唯一的動物專用藥，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、動力學特點優(yōu)良的特點，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均顯示良好的抗菌活性［1-3］。目前國內(nèi)關(guān)于頭孢喹肟乳房注入劑的研究越來越多［4-6］，因此加強頭孢喹肟在奶牛乳汁中的殘留消除研究顯得尤為重要。本試驗在建立的奶牛乳汁中頭孢喹肟的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法（UPLCMS／MS）的基礎(chǔ)上，進行了奶牛給藥硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑后在乳汁中的殘留消除研究，旨在為制定硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑的休藥期和臨床合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 頭孢喹肟對照品：含量≥80.1%，批號K0320906，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑（3 g∶150 mg／支），批號：111021，由河北遠征藥業(yè)有限公司提供；乙腈、甲醇、正己烷與甲酸均為色譜純；氯化鈉為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Micromass Quattro LC，配電噴霧離子源）；分析天平（Sartorius CPA225D，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；天平（JJ500，常熟市雙杰測試儀器廠）；組織勻漿機（AM-2，日本Nissei公司）；高速冷凍離心機（5804R，德國Eppendorf公司）；渦旋混合器（HQ-60-II，北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；超聲清洗儀（KQ2200型，昆山市超聲儀器有限公司）；固相萃取裝置（美國Waters公司）；氮吹儀（N-Evap 112，美國Organomation Associates公司）；Oasis HLB固相萃取柱（美國Waters公司）。

1.1.3 主要溶液配制 精密稱取頭孢喹肟對照品約12.48 mg，于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成濃度為1 mg／mL的頭孢喹肟標準貯備液。準確量取1 mg／mL頭孢喹肟標準貯備液1 mL和0.1 mL，于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，配制成濃度為100 μg／mL和10 μg／mL的標準工作液。

1.1.4 實驗動物 18頭剛進入干乳期的健康奶牛，由四川涼山州科華奶牛繁育有限公司奶牛場提供。給予正常飼料，自由飲水，飼料和飲水中不含頭孢類等抗菌藥物。

1.2 方法

1.2.1 給藥及采樣 將試驗奶牛隨機分為6個組（I、II、III、IV、V、VI組，每組3頭），根據(jù)每頭奶牛的配種記錄計算預產(chǎn)期。I、II、III、IV、V、VI組每頭奶牛的4個乳區(qū)分別在預產(chǎn)期前42、35、28、21、14、7 d進行給藥，灌注硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑，給藥劑量為1支／乳區(qū)，僅給藥一次。各試驗奶牛在產(chǎn)犢后第0、12、24、36、48、60、72 h采集奶樣，-20℃低溫保存，備用。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取 取解凍的空白或供試牛奶試料（5.00±0.02）g，于50 mL離心管中，加水8 mL、NaCl 3 g，渦動2 min，超聲20 min，10000 r／min 0℃離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，加正己烷10 mL，渦動30 s，10000 r／min 0℃離心10 min。棄上層正己烷，下層水相備用。

1.2.2.2 凈化 依次用甲醇2 mL和水2 mL活化Oasis HLB固相萃取柱，取備用液過柱，再用水2 mL淋洗，用甲醇-水溶液（60∶40，V／V）2 mL洗脫。洗脫液30℃水浴氮氣吹至小于500 μL，加入含0.1%甲酸的水溶液定容至1 mL，渦動1 min復溶，14000 r／min離心10 min，過濾膜后供UPLC-MS／MS測定。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱：BEH C18（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液；B相為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0、0.5、1.5、2.0、2.1、3.5 min時，B相分別為10%、10%、90%、90%、10%、10%；流速：0.3 mL／min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；電離電壓：3.0 kV；源溫：100℃；霧化溫度：350℃；錐孔氣流速：30 L／h；霧化氣流速：600 L／h；測試藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 頭孢喹肟的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

2 試驗結(jié)果

2.1 方法學驗證

2.1.1 線性范圍 制備基質(zhì)匹配標準曲線，濃度分別為0、50、250、500、2500、5000、10000、15000 μg／L，以測得特征離子峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y＝25.027x+78.4327，相關(guān)系數(shù)r為0.9998，表明藥物在50～15000 μg／L的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.1.2 特異性 處理不同來源空白樣品，目標化合物的保留時間附近沒有雜質(zhì)干擾，空白樣品、空白牛奶添加樣品、基質(zhì)標準溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1-圖3。

圖1 空白牛奶樣品特征離子質(zhì)量色譜圖

圖2 空白牛奶添加樣品特征離子質(zhì)量色譜圖（10 μg／kg）

圖3 基質(zhì)標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖（50 μg／L）

2.1.3 準確度和精密度 進行添加回收試驗，選擇1／2MRL（10 μg／kg）、MRL（20 μg／kg）、2MRL（40 μg／kg）三個濃度，各濃度制備6個平行樣品，重復3批次。表2結(jié)果表明，藥物在10、20、40 μg／kg添加濃度水平上的回收率為80%～110%之間，批內(nèi)變異系數(shù)≤7.4%，批間變異系數(shù)≤6.3%。

2.1.4 靈敏度 添加適量標準工作液于5 g空白樣品，經(jīng)提取凈化后測定。以3倍信噪比為方法的檢測限，測得牛奶中頭孢喹肟的檢測限為2 μg／kg，以10倍信噪比為方法的定量限，測得牛奶中頭孢喹肟的定量限為10 μg／kg。

2.2 試驗牛產(chǎn)犢后乳汁中頭孢喹肟的殘留消除情況 由表3數(shù)據(jù)可看出，預產(chǎn)期前7 d給藥（VI組），奶牛產(chǎn)犢后0 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量最高，約為3000 μg／kg，產(chǎn)犢后12 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量迅速降為257.6～627.8 μg／kg，之后消除趨于緩慢，產(chǎn)犢后72 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量降至MRL（20 μg／kg）附近，濃度為17.1～31.3 μg／kg。預產(chǎn)期前14 d給藥（V組），奶牛產(chǎn)犢后0 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量為243.2～809.7 μg／kg，產(chǎn)犢后12 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量迅速降至MRL以下，均低于檢測限。預產(chǎn)期前21 d給藥（IV組），奶牛產(chǎn)犢后0 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量為37.3～83.1 μg／kg，產(chǎn)犢后12 h采集奶樣的頭孢喹肟殘留量均低于檢測限。預產(chǎn)期前28 d給藥（III組），奶牛產(chǎn)犢后所有采集奶樣的頭孢喹肟殘留量均低于檢測限。

表2 牛奶中頭孢喹肟添加回收試驗結(jié)果

表3 單次使用（150 mg／乳區(qū)）硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑奶牛產(chǎn)犢后各時間點采集奶樣的頭孢喹肟殘留量檢測結(jié)果

2.3 休藥期計算 根據(jù)上述試驗所得的殘留消除數(shù)據(jù)，根據(jù)我國牛奶中頭孢喹肟MRL（20 μg／kg）規(guī)定和歐盟關(guān)于休藥期計算的要求，以雙單側(cè)95%置信區(qū)間計算，按推薦用法和用量［干乳期乳房內(nèi)注入，1支（150 mg）／乳區(qū)，只用藥一次］給奶牛使用硫酸頭孢喹肟乳房（干乳期）注入劑，在預產(chǎn)期7 d前給藥，建議棄奶期為產(chǎn)犢后5 d；在奶牛預產(chǎn)期14 d前給藥，建議棄奶期為產(chǎn)犢后1 d；在奶牛預產(chǎn)期21 d前給藥，建議棄奶期為產(chǎn)犢后1 d；在奶牛預產(chǎn)期28 d前給藥，產(chǎn)犢后分泌乳汁已檢測不到頭孢喹肟殘留，建議棄奶期為產(chǎn)犢后0 d。

3 討論

目前，檢測頭孢喹肟在可食性組織和牛奶中的殘留方法主要有微生物法［7］、酶聯(lián)免疫法［8］、HPLC法［9-11］以及HPLC-MS／MS［12-13］，其中以HPLC法和HPLC-MS／MS應用最多。本試驗采用HPLCMS／MS方法檢測牛奶乳汁中頭孢喹肟殘留，專屬性好，峰形良好，靈敏度高，測定牛奶中頭孢喹肟的檢測限為2 μg／kg，定量限為10 μg／kg，歐盟制定頭孢喹肟在牛奶中的最大殘留量（MRLs）為20 μg／kg，因此能夠滿足頭孢喹肟在乳中殘留檢測的要求。

國內(nèi)外關(guān)于頭孢喹肟的殘留研究結(jié)果均表明按合理的給藥方案，經(jīng)過休藥期后，各種組織器官的殘留量均低于規(guī)定的限度［14］。頭孢喹肟在動物可食性組織和乳中殘留消除速度較快［14］。乳房灌注頭孢喹肟后在泌乳牛中的殘留消除研究結(jié)果顯示［9］，僅能在治療后24 h的腎臟檢出頭孢喹肟，且含量低于200 μg／kg，而在用藥后第一次的擠奶中殘留最高，在第10次泌乳期后，所有批次的牛奶樣品的殘留濃度均低于20 μg／kg。Ehinger等［4］研究了奶牛干乳期應用頭孢喹肟后在可食性組織和乳汁中殘留，藥物未進入體循環(huán)，產(chǎn)后乳汁和所有可食性組織中頭孢喹肟的殘留濃度均低于最大殘留限量。從本實驗的結(jié)果來看，在干乳期給藥硫酸頭孢喹肟乳房注入劑后，藥物在奶牛乳汁中代謝較快，硫酸頭孢喹肟殘留量可很快降至MRL（20 μg／kg）以下。

［1］ CVMP（Committee for Veterinary Medicial Products）.Cefquinome Summary Report［R］.London：European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，1995.

［2］ CVMP（Committee for Veterinary Medical Products）.Cefquinome Summary Report-1［R］.London：European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，1999.

［3］ CVMP（Committee for Veterinary Medical Products）.Cefquinome Summary Report-2［R］.London：European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，2003.

［4］ Ehinger A M，Allan M J，Hartmann M，et al.Deletion of residues in edible tissues and milk following treatment with a new cefquinome dry cow formulation［R］.Quebec：Intervet Innovation GmbH，2004.

［5］ 魏占勇，劉欣，魏麗娟，等.硫酸頭孢喹肟乳房注入劑在牛奶中的藥代動力學研究［J］.中國獸藥雜志，2014，48（12）：22-26.

［6］ 閆星，劉義明，路永強，等.硫酸頭孢喹肟乳房注入劑對泌乳期奶牛的安全性研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（11）：278-282.

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（編輯：李文平）

Residual Study of Cefquinome Sulfate Intramammary Infusion（Dry Period）in Milk

WEI Zhan-yong1，LIU Xin1，WEI Li-juan1，GENG Zhi-xia1?，ZHANG Ying1，SONG Ting-ting1，JIA Xing1，LIAN Li-juan1，XIA Xi2
（（1.HeBei Yuanzheng Pharmaceutical Co.，Ltd.Shijiazhuang 050041，China；2.China Agriculturial University，Beijing 100083，China）

The high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry method（UPLC-MS／MS）was established for the residual study of cefquinome sulfate in milk.18 healthy cows that just entering the dry period were selected and were randomly divided into 6 groups.The 6 groups of cow were respectably administrated cefquinome sulfate intramammary infusion（dry period）once in mammary region at the dose of 3 g for each region and their milk were collected after calving.The results demonstrated that：administrated 7 days before preterm birth，concentration of cefquinome in milk collected 72h after calving decreased to about MRL；administrated 14 and 21 days before preterm birth，concentration of cefquinome in milk collected 12h after calving dropped below MRL，all below the detection limit；administrated 28、35 and 42 days before preterm birth，concentration of cefquinome in all the milk were below the detection limit.It is suggested that the milk withholding period were respectably 5，1 and 0 days that administrated cefquinome sulfate intramammary infusion7，14 and 21 days before preterm birth.

cefquinome；milk；residue；UPLC-MS／MS

2015-02-05

A

1002-1280（2015）05-0049-05

S859.84

魏占勇，高級工程師，從事藥物制劑研究方面的研究。

耿智霞。E-mail：gengzhixia2011＠aliyun.com