劉丹，楊承槐，吳華偉，李啟紅，高金源，陳建，郎洪武

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

雞傳染性法氏囊病病毒BC6／85株VP2基因的原核表達、純化及鑒定

劉丹，楊承槐，吳華偉，李啟紅，高金源，陳建，郎洪武?

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

為獲得可用于雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）抗體檢測的重組抗原VP2蛋白，根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBDV VP2序列設(shè)計一對特異性引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆IBDV經(jīng)典標準攻毒株（BC6／85株）的VP2基因，插入質(zhì)粒pET-32a中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-VP2，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了以包涵體形式表達的重組蛋白。重組蛋白純化后，Western-blot檢測表明具有良好的反應(yīng)原性。本研究為下步建立IBDV抗體的間接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

雞傳染性法氏囊病病毒；VP2基因；克隆；原核表達

雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）屬于雙RNA病毒科，其基因組由A和B兩個雙鏈RNA片段組成，編碼5種病毒蛋白，分別為VP1、VP2、VP3、VP4和VP5［1］。其中VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護性抗原，含有能誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體能被動地保護宿主免受IBDV的感染［2-3］，VP2還與病毒毒力、病毒抗原變異及細胞凋亡等有關(guān)［4-5］，已成為近年來眾多學(xué)者研究的熱點。

眾多研究人員利用VP2的免疫原性研究抗IBD的基因工程疫苗，已經(jīng)在大腸桿菌、重組桿狀病毒、酵母等諸多表達系統(tǒng)中，成功表達VP2蛋白［6-8］。這些表達系統(tǒng)表達的VP2蛋白都能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的中和抗體，并且國內(nèi)已有商品化的基因工程亞單位疫苗［9］，但利用VP2建立相關(guān)檢測方法的研究卻甚少。為了建立監(jiān)測IBDV抗體的ELISA方法和研究VP2蛋白的免疫原性，本試驗對IBDV經(jīng)典標準攻毒株（BC6／85株）的VP2基因進行克隆并構(gòu)建其原核重組表達載體，進行誘導(dǎo)表達、純化和鑒定，旨在獲得可用于IBDV抗體檢測的重組抗原VP2蛋白，為IBDV抗體檢測方法的建立和基因工程疫苗的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細菌和載體 IBDV BC6／85株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供；E.coli TOP10感受態(tài)細胞，購于天根生化科技有限公司；Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，購于康為世紀生物科技有限公司；pMD18-T載體，購于大連寶生物工程有限公司；pET-32a載體由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoR Ι、Xho Ι、Marker DL2000、Marker DL15000，2×SDS-PAGE loading buffer，蛋白Marker，均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Trizol?Reagent試劑盒均購自天根生化科技有限公司；Donkey anti-chicken IgY購自康為世紀生物科技有限公司；IPTG為Sigma公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為分析純級試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBDV基因組序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計一對特異性引物，由北京Invitrogen公司合成。上游引物P1：CGAATTCATGACAAACCTG?CAAGAT，下游引物P2：CCGCTCGAGTCACCT? TAGGGCCCGGATTAT，為方便目的基因的克隆及表達，在上、下游引物的5’端分別引入EcoR Ι和Xho Ι酶切位點（以下劃線指示），VP2基因的擴增長度約為1356 bp。

1.2.2 IBDV總RNA的提取 按照Trizol?Reagent試劑盒說明書提取病毒總RNA。

1.2.3 IBDV VP2基因的RT-PCR擴增 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行第一鏈cDNA的合成。以cDNA為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol／L each）4 μL，P1和P2引物（濃度均為10 μmol／L）各1 μL，cDNA模板5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，補加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，52℃45 s，72℃45 s，共30個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA回收試劑盒回收預(yù)期的目的片段。

1.2.4 IBDV VP2基因的克隆與鑒定 將回收的目的片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒pMD18T-VP2。將PCR和酶切鑒定均正確的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測序。

1.2.5 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 將陽性重組質(zhì)粒pMD18T-VP2用EcoR Ι和Xho Ι雙酶切后回收并純化，與同樣雙酶切的原核載體pET-32a進行連接，得到重組原核表達載體pET-32a-VP2，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，送Invitrogen公司測序。

1.2.6 pET-32a-VP2的誘導(dǎo)表達與條件優(yōu)化 將重組質(zhì)粒pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化至表達菌株Rosetta（DE3），挑取單個菌落接種含Amp+的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，在誘導(dǎo)后1、2、3、4、5、6 h分別取出1 mL，離心2 min收集菌體，用PBS重懸沉淀，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，水浴煮沸10 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳以確定IPTG的最佳誘導(dǎo)時間。

分別取1 mL培養(yǎng)物5份，加入IPTG至終濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol／L，按上法進行誘導(dǎo)表達和處理，SDS-PAGE檢測表達情況，以確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度；在IPTG濃度為1 mmol／L時，在25℃、30℃和37℃分別對重組菌進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)時間為5 h，以確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.7 重組蛋白的純化和鑒定 重組菌按優(yōu)化好的條件進行誘導(dǎo)表達后，離心收集菌體，超聲波裂解菌體，分別收集上清及沉淀進行SDS-PAGE蛋白電泳，確定表達產(chǎn)物是可溶性蛋白還是包涵體蛋白。對重組蛋白進行過柱純化，純化步驟參考王倩倩等方法［10］。應(yīng)用Western-blot鑒定純化的重組蛋白，步驟如下：將純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印2 h，封閉2 h；PBST洗滌3次，加入PBS稀釋的雞傳染性法氏囊病陽性血清（1∶500稀釋）或His單抗，作用1 h；PBST洗滌3次，加入1∶10000稀釋的Donkey anti-chicken IgY或HRP標記的羊抗鼠二抗，作用1 h；PBST洗滌3次，用TMB顯色試劑盒進行顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VP2基因的RT-PCR擴增 應(yīng)用所設(shè)計的特異性引物對IBDV BC6／85株的VP2基因進行RT-PCR擴增，得到一條長度約為1356 bp的目的條帶（圖1），與預(yù)期片段大小一致。

圖1 IBDV BC6／85株VP2基因的RT-PCR擴增

2.2 pMD18T-VP2的PCR和酶切鑒定 將重組質(zhì)粒pMD18T-VP2進行PCR鑒定，可擴增出1356 bp大小的特異片段；經(jīng)EcoR Ι和Xho Ι雙酶切鑒定，可獲得與預(yù)期大小一致的片段（圖2）。將PCR和酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測序，測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pMD18T-VP2重組質(zhì)粒。

圖2 pMD18T-VP2的PCR和酶切鑒定

2.3 VP2基因原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 將經(jīng)PCR初步鑒定為陽性的重組原核表達載體pET-32a-VP2，再以EcoR Ι和Xho Ι對其進行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條條帶，一條為約5900 bp的載體片段，一條約為1356 bp大小的目的基因片段（圖3），對重組質(zhì)粒的測序結(jié)果表明原核重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 pET-32a-VP2的PCR和酶切鑒定

2.4 pET-32a-VP2的誘導(dǎo)表達與條件優(yōu)化

2.4.1 最佳誘導(dǎo)時間的確定 將重組質(zhì)粒pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化至表達菌株Rosetta（DE3），進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE結(jié)果表明，誘導(dǎo)5 h時表達量最高（圖4）。

2.4.2 IPTG誘導(dǎo)濃度的確定 由圖5可知，IPTG濃度在1 mmol／L時，表達量最高，故確定該濃度為最佳誘導(dǎo)濃度。

2.4.3 最佳誘導(dǎo)溫度的確定 在25、30和37℃分別對重組菌進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE結(jié)果顯示在37℃時表達量最高，確定為最佳的誘導(dǎo)溫度（圖6）。

2.5 重組蛋白純化及鑒定

2.5.1 重組蛋白可溶性分析結(jié)果 重組菌在37℃、1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)表達5 h，離心收集菌體，超聲波裂解菌體，分別收集上清及沉淀進行SDS-PAGE蛋白電泳，由圖7可以看出，在上清中未見預(yù)期蛋白條帶，在沉淀中可見預(yù)期的蛋白條帶，說明表達的蛋白主要以包涵體形式存在。

2.5.2 重組蛋白的純化和Western-blot鑒定 用SDS-PAGE電泳鑒定純化后的表達產(chǎn)物，在65 kD處得到單一的條帶，與預(yù)期大小相符，表明純化的產(chǎn)物為VP2蛋白（圖8）。純化的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，進行Western-blot鑒定，如圖9所示，復(fù)性蛋白能分別被抗His單克隆抗體和雞傳染性法氏囊病陽性血清特異性識別，表明純化的VP2蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 pET-32a-VP2 IPTG最佳誘導(dǎo)時間的確定

圖5 pET-32a-VP2 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定

圖6 pET-32a-VP2 IPTG最佳誘導(dǎo)溫度的確定

圖7 pET-32a-VP2表達形式的確定

圖8 純化的VP2蛋白SDS-PAGE電泳鑒定圖

圖9 純化的VP2蛋白的Western-blot鑒定圖

3 討論

血清學(xué)方法檢測雞群的IBD感染情況和雞群免疫后的抗體水平，有利于建立免疫監(jiān)測體系、進行疫苗的免疫效力評估和制定合理的免疫程序。國外已有商品化的IBDV抗體ELISA檢測試劑盒，但價格昂貴不利于推廣應(yīng)用，國內(nèi)商品化試劑盒大多以全病毒作為包被抗原，進行ELISA檢測時有較強的背景反應(yīng)和非特異性反應(yīng)，所以利用表達的蛋白作為包被抗原，建立相關(guān)檢測方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

VP2不僅是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，還是宿主保護性抗原，與中和抗體產(chǎn)生、病毒毒力變異及抗原漂變等有關(guān)［11］，因此利用VP2來研發(fā)基因工程疫苗成為近年來的研究熱點，先后研制了不同表達系統(tǒng)的VP2亞單位疫苗［12-14］。但利用VP2建立ELISA抗體檢測方法的研究卻甚少，為獲得可用于IBDV抗體檢測的重組抗原VP2蛋白，本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達IBDV的VP2蛋白，關(guān)鍵問題是選擇合適的表達載體和大腸桿菌表達菌株。最初構(gòu)建原核表達載體，選擇了pET-28a載體，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達菌，SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達量很低，且表達的目的條帶大小與載體上條帶接近，不利于區(qū)分目的條帶。然后考慮使用pET-32a載體，誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)在BL21（DE3）中不表達，改用表達菌株Rosetta（DE3），表達量明顯提高，這可能是由于Rosetta能提供稀有密碼子AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA所需的tRNA，從而提高包含稀有密碼子的基因片段的表達量。

VP2蛋白表達后可觀察到約65 kD的條帶，與預(yù)期大小一致，這也與國內(nèi)其他學(xué)者原核表達的vp2蛋白大小一致［15-16］。將表達的目的蛋白純化后，用Western blot檢測目的蛋白，一抗為雞傳染性法氏囊病陽性血清，二抗為驢抗雞IgY，結(jié)果顯示目的蛋白處出現(xiàn)一條特異性條帶，而空載體對照則沒有，進一步表明表達的目的蛋白是VP2蛋白，并且表達的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本研究為下步研究VP2的免疫原性和建立IBDV抗體檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯：李文平）

Prokaryotic Expression，Purification and Identification of VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Virus BC6／85 Strain

LIU Dan，YANG Cheng-huai，WU Hua-wei，LI Qi-hong，GAO Jin-yuan，CHEN Jian，LANG Hong-wu?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China）

In order to obtain recombinant VP2 antigen for chicken infectious bursal disease virus（IBDV）antibody detection，a pair of specific primers were designed according to the published sequence of IBDV VP2 gene.The VP2 gene was amplified by RT-PCR from IBDV BC6／85 strain and cloned into pET-32a vector，the recombinant plasmid pET-32a-VP2 was induced by IPTG to get the recombinant protein expressed in inclusion body forms.After the recombinant protein was purified，Western blot detection showed that the expressed protein had good antigenicity and could be used for IBDV antibody detection.The research provides a foundation for IBDV antibody detection research and development of new vaccines.

infectious bursal disease virus；BC6／85Strain；VP2 gene；prokaryotic expression

2014-11-25

A

1002-1280（2015）05-0017-05

S858.31

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所所級課題（201421）

劉丹，助理研究員，從事豬用疫苗檢驗及相關(guān)研究工作。

郎洪武，E-mail：langhongwu＠ivdc.org.cn