鄧健男，曾靜玲，李海龍，楊植媛，楊長(zhǎng)生

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430100；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

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當(dāng)歸多糖對(duì)血管型癡呆低糖低氧PC12細(xì)胞凋亡的影響

鄧健男1，曾靜玲1，李海龍2，楊植媛2，楊長(zhǎng)生2

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430100；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

目的：觀察當(dāng)歸多糖 (Angelica Sinensis Polysaccharide ride，ASP ) 對(duì)低亞硫酸鈉誘導(dǎo)的低糖低氧PC12細(xì)胞模型的影響，探討當(dāng)歸多糖影響細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：將體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺嗜鉻腫瘤細(xì)胞(PCl2細(xì)胞)分為空白對(duì)照組、OGD(oxygen-glucose deprivation)模型組、當(dāng)歸多糖組，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，采用比色法檢測(cè)LDH、T-SOD、MDA酶學(xué)指標(biāo)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用RT-PCR檢測(cè)Bax和Bcl-2表達(dá)情況。結(jié)果：缺糖缺氧損傷組細(xì)胞存活率均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，各劑量當(dāng)歸多糖組細(xì)胞存活率均高于損傷組，且200μg·L-1濃度的當(dāng)歸多糖組細(xì)胞存活率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：當(dāng)歸多糖可提高LDH、T-SOD活性，降低MDA含量，有效降低細(xì)胞凋亡率，可不同程度地保護(hù)PC12細(xì)胞。

當(dāng)歸多糖；血管型癡呆；細(xì)胞凋亡

細(xì)胞缺糖缺氧(Oxygen-Glucosedeprivation，OGD)損傷多見(jiàn)于腦缺血、心肌缺血等缺血性損傷疾病。ODG是血管性癡呆(Vascular dementia，VD)的典型癥狀，其發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)細(xì)胞所處的OGD環(huán)境有密切關(guān)系。壞死和凋亡是缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷的兩種主要形式。當(dāng)歸作為中醫(yī)圣藥，含有阿魏酸、藁本內(nèi)酯、當(dāng)歸多糖等多種成分，對(duì)免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等均有一定的藥理作用[1-2]。筆者選擇當(dāng)歸多糖進(jìn)行研究，嘗試從酶學(xué)角度揭開(kāi)當(dāng)歸治療VD的機(jī)制。

1 材料與儀器

PC-12細(xì)胞(上海中科院生物研究所)；LDH、T-SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20110928)；新生小牛血清(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，批號(hào)：20120430)；低亞硫酸鈉(天津精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20120405)；Benchmark plus連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海新振儀器設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)株式會(huì)社，型號(hào)：IX71)；COULTER EPICS XL流式細(xì)胞儀(美國(guó)beckman公司)；CFX-96實(shí)時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)(美國(guó)博樂(lè)公司)。

2 方法

2.1 VD細(xì)胞模型制備和分組

參考石瑞麗等[3-4]方法稍加改進(jìn)建立OGD模型，在CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中，采用含15%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PC12細(xì)胞，2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將正常DMEM培養(yǎng)液(含15%的新生小牛血清)培養(yǎng)的PC12細(xì)胞作為正常對(duì)照組；在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，將各組缺糖缺氧1、4、12h的PC12細(xì)胞模型組分別用含20mmol·L-1與40mmol·L-1低亞硫酸鈉的無(wú)糖PBS液培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后作為模型組，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

2.2 四氮唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞活力

采用 MTT 法檢測(cè)造模后PC12細(xì)胞的活力變化，待PC12細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)·mL-1。將上述各組細(xì)胞懸液分別以100μL/孔的計(jì)量滴入96孔培養(yǎng)板，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照孔和調(diào)零孔，向調(diào)零孔中加入100μL DMEM完全培養(yǎng)基，向?qū)φ战M孔中加入100μL細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)處理后各組每孔加入MTT 10μL，37℃孵育4h后移棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在570nm波長(zhǎng)下，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，記錄結(jié)果。

2.3 生化法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH、MDA和SOD含量

經(jīng)損傷處理后，收集細(xì)胞上清液，參照試劑盒說(shuō)明書，采用比色法于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上檢測(cè)上清液中LDH、MDA和SOD活性。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況

采用Annexin V-FITC和PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個(gè)·mL-1，接種于T-50培養(yǎng)瓶中，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，記錄激發(fā)光波長(zhǎng)為475nm處的熒光強(qiáng)度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，40mmol·L-1低亞硫酸鈉1h模型組細(xì)胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率又有所回升，可能與造模劑的逐漸消耗有關(guān)；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞存活率均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸多糖對(duì)不同濃度低亞硫酸鈉造模各組細(xì)胞存活率的影響 ±s,n=6)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

3.2 酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

與模型組比較，各組細(xì)胞溶液MDA含量均顯著降低，T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，40mmol·L-1低亞硫酸鈉模型組細(xì)胞MDA含量顯著升高，T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度的當(dāng)歸多糖作用于PC12細(xì)胞后，與模型組比較，200μg·L-1當(dāng)歸多糖組細(xì)胞MDA含量顯著降低，T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

各劑量當(dāng)歸多糖組細(xì)胞存活率均高于損傷組，且200μg·L-1濃度當(dāng)歸多糖組細(xì)胞存活率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

組別LDH活力(U·mL-1)T-SOD活力(U·mL-1)MDA含量(nmol·mL-1)空白組68.39±5.131.45±0.073.31±0.4340mmol·L-1低亞硫酸鈉組46.43±4.13*1.24±0.06*7.10±0.27*25μg·L-1組48.72±4.47#1.30±0.06#6.06±0.31#50μg·L-1組52.49±5.12#1.32±0.05#4.60±0.44#100μg·L-1組56.81±4.47#1.34±0.06#3.63±0.56#200μg·L-1組56.76±7.23#1.32±0.04#4.35±0.41#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

圖1 各濃度當(dāng)歸多糖對(duì)細(xì)胞凋亡率影響

3.4 RT-PCR檢測(cè)Bax和Bcl-2的表達(dá)情況

隨著劑量的增加，當(dāng)歸多糖給藥組細(xì)胞Bax表達(dá)量逐漸降低，Bcl-2表達(dá)量逐漸升高，與空白組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別BaxBcl-2空白組0.85±0.031.05±0.0640mmol·L-1低亞硫酸鈉造模組1.00±0.001.00±0.0025μg·L-1當(dāng)歸多糖組1.52±0.06△1.54±0.13△50μg·L-1當(dāng)歸多糖組1.39±0.05△2.16±0.23△100μg·L-1當(dāng)歸多糖組1.02±0.03△3.29±0.34△200μg·L-1當(dāng)歸多糖組0.93±0.02△7.07±0.47△

注：與空白組比較，△P<0.05。

4 討論

腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡類型包括壞死、凋亡和自噬三種[5]，由于凋亡和自噬延遲發(fā)生，使其成為藥物治療的靶點(diǎn)，但自噬在其中的作用還存在爭(zhēng)議[6]?？姶好鞯萚7]通過(guò)對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡在細(xì)胞OGD損傷過(guò)程的早期和晚期分別占有主導(dǎo)地位。凋亡蛋白表達(dá)引起細(xì)胞死亡，凋亡造成的神經(jīng)細(xì)胞大量丟失可能是VD發(fā)生的原因[8]。Bcl-2家族基因的表達(dá)和調(diào)控對(duì)細(xì)胞的凋亡有著至關(guān)重要的作用，其可通過(guò)多種通路參與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的基因，其中Bax作為Bcl-2活性的主要調(diào)控因子，參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程[9]。

采用一定濃度的連二亞硫酸鈉與培養(yǎng)液中的低濃度O2反應(yīng)模擬缺氧環(huán)境，通過(guò)無(wú)糖PBS緩沖液模擬缺糖環(huán)境，可有效避免頻繁開(kāi)合培養(yǎng)箱導(dǎo)致的造模環(huán)境不穩(wěn)的弊端，更方便有效地模擬ODG模型[3-4]。

最新研究表明，當(dāng)歸提取物以及當(dāng)歸組成的復(fù)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血管性癡呆患者的行為學(xué)和海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)等有較好的改善作用。大量文獻(xiàn)提示當(dāng)歸相關(guān)制劑對(duì)心血管疾病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等組織的Bax和Bcl-2表達(dá)有明顯調(diào)節(jié)作用，提示當(dāng)歸有效成分對(duì)血管性癡呆具有潛在的治療作用[10-13]。本研究結(jié)果表明當(dāng)歸多糖能顯著提高體外培養(yǎng)PC12的T-SOD、LDH的生物活性，降低MDA含量，降低細(xì)胞凋亡率，這也表明當(dāng)歸多糖能有效提高PC12的抗凋亡能力，可能與其調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達(dá)有關(guān)。

[1] RICE JE,VANNUCCIRC,BRIERLEY JB.Theinfluence of immaturity on hypoxic-ischemic Brain damage in the rat[J].Ann Neurol,1981,9(2):131-141.

[2] 劉醫(yī)輝,楊世英,馬偉林,等.當(dāng)歸藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2014,21(22):192-196.

[3] 石瑞麗,胡金鳳,孔令雷,等.瓜子金皂苷己對(duì)連二亞硫酸鈉致氧糖剝奪/復(fù)供誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2013,29(3):333-336.

[4] 許蜀閩,王培勇,馬紅英.連二亞硫酸鈉在建立培養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)氧環(huán)境中的應(yīng)用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(4):359-360.

[5] LIPTON P.Ichemic cell death in brain neurons[J].Physiol Rev,1999(79):1431-1568.

[6] RAMIA,KGEL D.Apoptosis meets autophagy-like cell death in the ische-micpenumbra:two sides of the game coin[J].Autophagy,2008,4(4):422-426.

[7] 繆春明,張勇,王偉偉,等.自噬及凋亡相關(guān)蛋白在PC12細(xì)胞缺糖缺氧過(guò)程中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2010,30(1):78-80.

[8] 羅永豎,藺心敬,李呂力,等.血管性癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和病理改變的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2008,28(18):1788-1789.

[9] ROSSE T,OLIVIER R,MONNEY L,et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome[J].Nature,1998,391(6666):496-499.

[10] 楊靜薇,田峻,鄒凡,等.當(dāng)歸對(duì)大鼠局灶性缺血腦組織細(xì)胞凋亡的作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2004,25(1):5-18.

[11] 章軍建,黃建英,張曉琴.當(dāng)歸對(duì)大鼠腦缺血半暗帶細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].卒中與神經(jīng)疾病,2001,8(1):8-10.

[12] 區(qū)炳雄,林海.當(dāng)歸多糖對(duì)染鉛小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)Bcl-2基因表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2006,33(7):901-902.

[13] 林莉,劉希婧,榮霞,等.當(dāng)歸對(duì)缺氧缺血性腦損傷幼年大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].四川解剖學(xué)雜志,2010,18(4):13-15.

[14] 劉凱,張選奮,張瑾,等.當(dāng)歸水煎液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及膠原合成的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2012,21(5):782-784.

[15] 雷燕,高倩,李悅山,等.黃芪、當(dāng)歸及其組方促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,23(10):753-756.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2015-03-09

鄧健男(1987-)，男，湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥師，研究方向?yàn)榉絼W(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2015)13-0007-03

10.11954/ytctyy.201513003