陰鉞玲，薛 睿，孫兆林*

(1.哈爾濱商業(yè)大學 生命科學與環(huán)境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱150076； 2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203)

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UPLC法測定炮制前后王不留行中Vaccarin含量

陰鉞玲1,2，薛 睿2，孫兆林2*

(1.哈爾濱商業(yè)大學 生命科學與環(huán)境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱150076； 2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203)

目的：考察炮制前后王不留行中Vaccarin的含量變化。方法：采用 UPLC 法測定王不留行中Vaccarin的含量，色譜柱為BEH C18( 100mm ×2.1mm，1.7μm)，以0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動相，流速為0.2mL·min-1，檢測波長為280nm，梯度洗脫(0～4min, 10%→20%B；4～10min，20%→45% B)，柱溫為35℃。結果：Vaccarin在生品王不留行中含量較高，而炮制后其含量大幅降低。結論：炮制前后王不留行中Vaccarin的含量可發(fā)生明顯變化，臨床用藥時需謹慎選擇。

王不留行；Vaccarin；UPLC；炮制；含量變化

王不留行為石竹科麥藍菜Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟種子，又名奶米、王不留、大麥牛、麥藍子。其在國內分布廣泛，以華北、東北為主，主治下乳消腫、經閉、痛經、乳癰腫痛等[1]。王不留行的主要成分為環(huán)肽、三萜皂苷、黃酮類化合物等[2-4]。《中國藥典》(2010年版)中收載的王不留行包括生品和炒制品兩種，目前生品應用較為廣泛，但是對生品和炮制品的區(qū)別尚未有研究報道。Vaccarin是《中國藥典》中規(guī)定的王不留行藥材質量評價的指標成分。因此，本文擬采用超高效液相色譜(UPLC)法，考察炮制前后王不留行中Vaccarin的含量變化，擬從化學成分含量變化的角度對生品和炒制品的區(qū)別進行研究。

1 儀器與試劑

Waters AcquityTM Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)色譜儀，包括四元泵、脫氣機、二極管陣列紫外檢測器、自動進樣器、柱溫箱、Empower 2色譜工作站(美國Waters公司)；分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團公司)；SK3300型超聲波清洗器(上?？茖в邢薰?。

Vaccarin對照品(批號MUST-15012111，成都曼思特生物科技有限公司)。生、炒王不留行藥材均為市售(同批為生、炒藥材各1份，北京同仁堂藥店，批號：20150120、20150209、20150311)。

乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液配制

精確稱定對照品Vaccarin 5.1mg, 加70%甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，搖勻，制得對照品儲備液。

2.2 供試品溶液配制

精密稱取生、炒王不留行藥材各700mg，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定重量，超聲(180W，35kHz)提取45min，放冷，再稱定重量，補足減失的重量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

BEH C18色譜柱( 100mm ×2.1mm，1.7μm)，流動相：0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫 (0～4min，10%→20% B; 4～10min，20%→45%B) ，流速：0.2mL·min-1，檢測波長：280nm，柱溫：35℃，進樣: 5.0μL。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

在“2.3”項色譜條件下，分別取空白樣品溶液、對照品溶液和供試品溶液各5.0μL進樣檢測，結果表明Vaccarin與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數不低于3 000，拖尾因子均在0.95～1.05之間，峰形良好。見圖1。

2.5 線性關系考察

精密吸取對照品儲備液1.0mL，置于10mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻。按照“2.3”項下色譜條件進行測定，進樣體積分別為 1.0、3.0、5.0、8.0、10.0μL，以Vaccarin對照品的進樣量(X)為橫坐標，對應色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線計算得回歸方程。見表1。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.5”項下對照品溶液和生、炒供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，每次進樣5.0μL，結果表明Vaccarin峰面積RSD (n=6)分別為0.43%、0.69%、0.58%，表明儀器精密度良好。

圖1 280nm處空白樣品溶液(A)、對照品溶液(B)、生王不留行樣品溶液(C)、炒王不留行樣品溶液(D)UPLC色譜

組分回歸方程r線性范圍(μg·μL?1)LODLOQVaccarinY=8000000X-1789840．99930．051～0．510．0150．051

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別取“2.2”項下對照品溶液和生、炒供試品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24h分別進樣5.0μL，按照“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰峰面積，計算得RSD (n=6)分別為0.62%、0.77%、0.74%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取20150120批次的生、炒王不留行藥材，平行樣品各6份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，按照“2.3”項下色譜條件測定。結果表明樣品中Vaccarin的含量平均值(n=6)為24.43%、31.79%，其RSD為1.4%、1.1%，表明該方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

準確稱取已知含量的上述生、炒王不留行藥材各6份，按“2.2”項下方法制得供試品溶液，分別精密加入Vaccarin對照溶液各5μL，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算得生、炒王不留行的平均回收率分別為98.4%、99.1%，RSD為0.77%、0.45%。

2.10 樣品測定

取不同批次的3批樣品，按照“2.2”項下方法分別制備3份供試品平行溶液，進樣5.0μL，記錄峰面積，計算其含量平均值，結果見表2(A：生王不留行，B:炒王不留行)。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

UPLC具有檢測快捷、操作方便、準確度高、重復性好的特點，現已廣泛應用于植物、礦物等天然中藥化學成分的分析，可為中國藥典中藥品快速檢驗技術的改進提供科學參考[5]。

本文建立了UPLC測定王不留行中Vaccarin含量的方法，經系統(tǒng)方法學驗證表明該方法穩(wěn)定可行。利用所建立的方法對炮制前后的王不留行中Vaccarin的含量變化進行考察，結果表明，炮制前后的3批藥材中Vaccarin的平均含量分別為0.41%和0.26%。《中國藥典》中規(guī)定王不留行生品和炒制品中Vaccarin含量分別應不低于0.40%和0.15%，因此本文中所測王不留行均符合藥典標準。

根據中藥炮制理論，種子類藥材在炒制后致使皮破裂而利于成分煎出，因此藥材炮制后的有效成分含量應高于未炮制藥材，然而本文卻有截然相反的發(fā)現。推測其原因可能是Vaccarin是黃酮苷類化合物，其在高溫條件下穩(wěn)定性較差。據文獻報道，側柏葉黃酮類化合物在50℃以上的環(huán)境中穩(wěn)定性明顯下降[6]；槲樹葉黃酮類化合物在80℃以上的環(huán)境中含量可隨溫度升高而逐漸下降[7]。因此，在本研究中，王不留行經炒制后Vaccarin含量明顯下降，可能是由于藥材經高溫炒制導致黃酮類成分破壞流失，但具體機制還需進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:49-50.

[2] 桑圣民,勞愛娜,王洪誠,等.中藥王不留行化學成分的研究(Ⅱ)[J].中草藥,2000,31(3):11-13.

[3] 桑圣民,毛士龍,勞愛娜,等.中藥王不留行化學成分的研究Ⅲ[J].天然產物研究與開發(fā),2000,12(3):12-15.

[4] 桑圣民,夏增華,毛士龍,等.中藥王不留行中黃酮甙類成分的研究[J].中國中藥雜志,2000,25(4):29-30.

[5] 劉明理,馬雙成.藥品快速檢驗技術研究及應用管理中需要加強的工作[J].中國藥事,2012,26(8):857-858, 870.

[6] 趙瑩,張建平,趙永光,等.側柏葉黃酮類化合物的穩(wěn)定性[J].河北科技師范學院學報,2008,22(3):30-33.

[7] 南海娟,郭延成,顏振敏,等.槲樹葉黃酮類化合物的提取及穩(wěn)定性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(4):234-237.

(責任編輯：尹晨茹)

2015-06-09

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(2012ZX09301001)

陰鉞玲(1989-)，女，哈爾濱商業(yè)大學碩士研究生，研究方向為中藥藥物分析。

孫兆林(1980-)，中國科學院上海藥物研究所中級實驗師，研究方向為中藥質量控制。

R284.2

A

1673-2197(2015)20-0020-02

10.11954/ytctyy.201520009