仇志富，顏 勇，吳曉光*，丁 方，時(shí)召平

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2.承德市中醫(yī)院 藥劑科，河北 承德 067000)

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姜黃素對(duì)腦缺血大鼠腦組織PI3K/AKT信號(hào)通路、Bcl-2、BAX的影響

仇志富1，顏 勇1，吳曉光1*，丁 方1，時(shí)召平2

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2.承德市中醫(yī)院 藥劑科，河北 承德 067000)

目的：探究姜黃素對(duì)腦缺血大鼠腦組織PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及作用機(jī)制。方法：將72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、姜黃素A組和姜黃素B組，每組18 只。其中模型組、姜黃素A、B組慢性腦缺血大鼠模型制備采用將大鼠兩側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎的方法，假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予等劑量生理鹽水。采用免疫組化法檢測大鼠PI3K、AKT、Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)情況，采用干濕重法檢測腦組織水含量，采用甲酰胺法檢測血腦屏障通透性。結(jié)果：與模型組比較，姜黃素組大鼠PI3K、AKT、Bcl-2蛋白含量均明顯增高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，腦組織含水量、BAX表達(dá)及伊文思藍(lán)含量顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：姜黃素對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī)制可能是其穿透血腦屏障后激活了PI3K/AKT信號(hào)通路，介導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)增加以及BAX蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而調(diào)節(jié)二者平衡。

姜黃素；PI3K/AKT信號(hào)通路；Bcl-2；BAX

腦缺血再灌注損傷中最常出現(xiàn)的是細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜多樣。在眾多細(xì)胞凋亡機(jī)制涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為重要，其發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制可能是通過調(diào)控凋亡蛋白和凋亡基因?qū)崿F(xiàn)的[1]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子可激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但其作為大分子，很難通過血腦屏障，探究一種既能穿透血腦屏障又能將PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路高效激活的藥物迫在眉睫。姜黃素是近年來發(fā)現(xiàn)的一種脂溶性酚類色素，其從姜黃、莪術(shù)等姜科姜黃屬植物的根莖中提取出來，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗細(xì)胞凋亡等藥理作用，可防止神經(jīng)元損傷，對(duì)神經(jīng)性病變具有保護(hù)作用，可改善外周神經(jīng)病、腦損傷等多種疾病癥狀[2]，但姜黃素對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響未見報(bào)道。本研究通過觀察姜黃素對(duì)腦缺血模型大鼠腦組織中的PI3K、AKT、Bcl-2、BAX等一系列蛋白的表達(dá)影響，觀察其對(duì)大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性的影響，探究姜黃素腦保護(hù)作用及其可能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與動(dòng)物

1.1 動(dòng)物

SD大鼠(清潔級(jí))，月齡11～12個(gè)月，數(shù)量72只，凈重220～250g，大鼠稱重編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分組：假手術(shù)組、模型組、姜黃素A、B組，每組各18只。

1.2 試劑及儀器

采用DMSO將姜黃素純品配制成終濃度為50mg/L的母液，過濾除菌后于-20℃避光存儲(chǔ)，每次使用前將培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(終濃度<1/1 000)。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒；兔抗人Bcl-2、BAX多抗，SABC、DAB、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀；MA1110型分析天平(精度0. 000 1g)。有機(jī)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 造模與干預(yù)

采用35mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后，參照NI J[3]方法造模，模型組、姜黃素A、B組腦缺血大鼠模型制備采用將兩側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎的方法，假手術(shù)組大鼠僅裸露頸總動(dòng)脈、神經(jīng)。于造模后第28天起，姜黃素A組(200mg/kg·d-1)和B組(300mg/kg·d-1)大鼠連續(xù)灌胃給予藥物35天；假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，頻率同給藥組。

2.2 PI3K、AKT蛋白表達(dá)檢測

在最后給藥的12h后，隨機(jī)從每組中選出6只大鼠，采用乙醚麻醉后進(jìn)行斷頭處理，摘取視交叉至漏斗部之間的腦組織，以10%CH3CHO浸泡，置于4℃冰箱固定48h，石蠟包埋，冠狀切片厚度5μm，常規(guī)脫蠟、酒精浸水，以枸櫞酸鹽緩沖液微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，水洗后分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT (1∶100)多抗，于4℃下靜置12h，孵育液30min，DAB顯色之后蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陽性細(xì)胞吸光度檢測：MiVnt圖形采集分析系統(tǒng)，取平均值，采用PBS作陰性對(duì)照。

2.3 凋亡調(diào)控蛋白檢測

按照SABC步驟染片，將給藥48h的腦組織切片脫蠟至水，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行，于高倍鏡下觀察胞漿著色，呈棕黃色的為陽性細(xì)胞。

2.4 腦組織含水量檢測

各組隨機(jī)選取6只大鼠斷頭、取腦，去除嗅球部分，稱濕重后于90℃干燥箱干燥24h，再稱重。按公式：含水量(%)=(濕重-干重) /濕重×100%，計(jì)算腦組織含水量。

2.5 血腦屏障通透性檢測

采用2%伊文思藍(lán)于每組遺留的6只大鼠尾部靜脈注射，3h后以水合氯醛麻醉，采用200mL生理鹽水于大鼠左心室注射沖洗血管內(nèi)血液，取腦稱量，腦組織放置于甲酰胺內(nèi)，于60℃下水浴一整天，勻漿后離心(轉(zhuǎn)速：1 000r/min、時(shí)間：6min)，于635nm波長處檢測上清液的OD值，計(jì)算伊文思藍(lán)含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)，方差分析采用one-way ANOVA方法，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若齊則采用LSD檢驗(yàn)，若不齊則采用Games-Howell檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠PI3K蛋白、AKT蛋白陽性表達(dá)時(shí)吸光度變化

PI3K蛋白、AKT蛋白若形成棕黃色物質(zhì)沉積說明已發(fā)生陽性表達(dá)。結(jié)果表明，模型組大鼠PI3K表達(dá)量較假手術(shù)組明顯升高(46.934±4.539)% ，AKT升高(55.29±2.06)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素A、B組大鼠PI3K表達(dá)分別增加了(67.85±6.43)%、(72.36±7.12)%，AKT分別增加了(65.39±4.64)%、(72.38±5.16)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達(dá)吸光度改變情況 (±s,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01。

3.2 各組大鼠腦組織含水量改變

模型組大鼠腦組織水含量較假手術(shù)組增加了(19.93±4.69)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素A、B組大鼠腦組織水含量較模型組分別下降了(13.99±1.98)%和(12.99±1.97)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織含量水及伊文思藍(lán)含量改變 (±s,n=6)

注：與較模型組比較，△P<0. 05；與假手術(shù)組比較，*P<0. 01。

3.3 血腦屏障通透性改變

模型組大鼠伊文思藍(lán)含量較假手術(shù)組增加(596.39±129.79)% ，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素A組、B組大鼠依文思藍(lán)含量分別降低了(42.97±7.92)%和(39.85±7.93)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3.4 各組大鼠Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)變化

在梗死灶周圍的皮質(zhì)或紋狀體內(nèi)可見Bcl-2陽性細(xì)胞，假手術(shù)組大鼠僅可呈現(xiàn)少量Bcl-2、BAX反應(yīng)。在缺血周邊區(qū)，模型組及給藥組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)量均較假手術(shù)組升高(P<0.01)，姜黃素給藥組大鼠Bcl-2表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.01)，模型組及姜黃素給藥組大鼠BAX蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)，姜黃素給藥A、B組BAX表達(dá)量均高于缺血組(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組大鼠腦缺血再灌注后Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)量比較 (±s,n=6)

注：與模型組比較，①P<0.05，②P<0.01。

3 討論

腦缺血引起的神經(jīng)元死亡主要以細(xì)胞凋亡為表現(xiàn)形式，細(xì)胞凋亡具有漸進(jìn)性，及時(shí)有效抑制或減少缺血半暗帶細(xì)胞凋亡是發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要手段。

PI3K (磷脂酰肌醇3激酶)/AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞生存的信號(hào)通路之一，其在細(xì)胞增殖、分化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面起到了重要作用[4]。腦缺血再灌注后，機(jī)體本身可以釋放出一些能夠激活酪氨酸激酶活性受體的物質(zhì)，如神經(jīng)細(xì)胞生長因子、整合素等，受體經(jīng)過磷酸化后可特異性與PI3K的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，從而激活PI3K。兼?zhèn)渲惣っ富钚耘c蛋白激酶活性的PI3K激活后可使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，生成第二信使PI3K，AKT作為PI3K下游的效應(yīng)分子可與之結(jié)合，在既能夠使AKT從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位的同時(shí)，又能夠改變其構(gòu)象，如此一來便可使AKT的Thr308位點(diǎn)以及Ser473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，使其由抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。作為調(diào)節(jié)位點(diǎn)的Thr308和Ser473的磷酸化作用的發(fā)生是一前一后、互相獨(dú)立的[5]，AKT活性的最終實(shí)現(xiàn)需要依賴Ser473 的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成為p-AKT，其可衡量該通路的活化程度，通過參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來起到促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用。AKT活化后控制凋亡的方式是通過直接將凋亡相關(guān)蛋白磷酸化或間接改變、編碼凋亡相關(guān)蛋白的基因表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，活化后的AKT通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白Bad、Caspase-3、NF-KB等，通過調(diào)控多種生長因子誘發(fā)細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞存活的生物學(xué)效應(yīng)[6-8]。

AKT磷酸化后能促使Ser136位點(diǎn)的Bad發(fā)生磷酸化，形成一個(gè)可與伴侶蛋白14-3-3結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)而形成復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物形成時(shí)，Bcl-2或BCL-xl形成的異源二聚體中的Bad便會(huì)脫落下來，從而增加胞質(zhì)中的Bcl-2或BCL-xl等的游離狀態(tài)，以此發(fā)揮抗凋亡作用[9]。人們?cè)趯?duì)小鼠進(jìn)行AKT基因剔除后發(fā)現(xiàn)，AKT的磷酸化水平有所降低，導(dǎo)致胞質(zhì)中Bcl-2表達(dá)下調(diào)，BAX表達(dá)上調(diào)，使腦損害程度[10]進(jìn)一步加重。AKT通過Bad磷酸化而將其激活，從而發(fā)揮抑制Bad加重腦損傷的作用；同時(shí)，又通過促進(jìn)Bcl-2和BCL-xl解離而發(fā)揮抗凋亡作用。采用特異性PI3K抑制劑處理后，可在一定程度上降低AKT對(duì)Bad的磷酸化效果。同時(shí)，AKT也能將Ser184位點(diǎn)的BAX磷酸化，阻止BAX形成二聚體，抑制其促凋亡功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠PI3K及AKT磷酸化表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著增加，但細(xì)胞凋亡顯著增多，血腦屏障通透性和含水量均顯著升高，Bcl-2表達(dá)量降低，BAX表達(dá)量升高，腦保護(hù)功能降低。給予姜黃素后不但可減輕血腦屏障通透性和水腫程度，還可有效抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)PI3K及AKT蛋白活性，升高Bcl-2并降低BAX水平。因此，姜黃素發(fā)揮腦保護(hù)作用的主要機(jī)制可能是其在穿透血腦屏障后激活了PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步介導(dǎo)Bcl-2、BAX發(fā)生相應(yīng)變化，即增加Bcl-2蛋白表達(dá)，降低BAX蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)二者之間的比例，然而PI3K/AKT信號(hào)通路激活后可介導(dǎo)多種凋亡因子發(fā)生相應(yīng)變化。本文僅研究了凋亡因子Bcl-2、BAX的變化，對(duì)于其他凋亡因子尚未進(jìn)行研究，姜黃素激活PI3K/AKT信號(hào)通路后是否也能介導(dǎo)其他凋亡因子發(fā)生改變尚不明確，故其具體機(jī)制亟待進(jìn)行更深入的研究。隨著對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡更加深入的研究以及與其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制的闡明，可為腦缺血的臨床治療提供更加明確的方向和靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

The Influence of Curcumin on PI3K/AKT Signal Pathway, the Bcl-2, BAX of Brain Tissue of Cerebral Ischemia Rats

Qiu Zhifu1,Yan Yong1,Wu Xiaoguang1，Ding Fang1，Shi Shaoping2

(1.Medical College of Chengde,Chengde 067000,China； 2.Department of Pharmacy，TCM Hospital of Chengde，Chengde 067000，China)

Objective:To explore the effects of curcumin on cerebral ischemia in rat brain PI3K/Akt signal transduction pathway and the possible mechanism.Methods:SD rats were randomly divided into four groups: sham operation group, model group, curcumin A group and curcumin B group, 18 rats in each group. The rats of model group, curcumin A, B group of chronic cerebral ischemia was prepared by the method of bilateral carotid artery ligation in rats, sham operation group and model group were given normal saline of the same. Immunohistochemistry was used to detect the expression of PI3K, AKT, Bcl-2, BAX protein, water content of brain tissue was detected by dry wet weight method, methanamide method to detect the permeability of blood brain barrier. Results:compared with model group, curcumin group, PI3K AKT and Bcl-2 protein were significantly increased (P<0.05,P<0.01,P<0.05), the water content of brain tissue, the expression of BAX and Evans blue content were significantly decreased (P<0.05,P<0.01,P<0.01),the significance are all obvious.Conclusion:Conclusion:the possible mechanism of the protective effect of curcumin on ischemic cerebral injury is the penetration of the blood-brain barrier after the activation of the PI3K/AKT signaling pathway, mediated by the increased expression of Bcl-2 protein, BAX protein expression decreased, the ratio between the two by adjusting to achieve.

Curcumin; PI3K/AKT Signaling Pathway; Bcl-2; BAX

2015-05-07

仇志富(1988-)，男，河北省承德醫(yī)學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。

吳曉光(1975-)，男，河北省承德醫(yī)學(xué)院副教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療腦病。

R285.5

A

1673-2197(2015)20-0011-03

10.11954/ytctyy.201520005