王紅波，吳 華，陳禪友，劉 琴，潘 磊，郭 瑞，胡志輝

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

番茄紅素（lycopene）是紅色的脂溶性色素，不溶于水，微溶于甲醇和乙醇，分子式為C40H56。番茄紅素主要由反式、9-順式、13-順式及15-順式四種異構(gòu)體組成[1]，順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素生物利用度及抗氧化功能皆優(yōu)于反式結(jié)構(gòu)的番茄紅素[2]，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。番茄經(jīng)加熱處理，其中的反式番茄紅素會(huì)順式異構(gòu)生成順式番茄紅素，有利于提高番茄紅素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。番茄紅素多見(jiàn)于西紅柿，其抗氧化活性約為β-胡蘿卜素的2倍[3]。番茄紅素對(duì)人體健康的功效促進(jìn)了番茄紅素在食品工業(yè)中的商業(yè)化發(fā)展。目前，食用番茄是人體獲取番茄紅素的主要方式。番茄紅素能減小機(jī)體細(xì)胞被活性氧自由基的氧化損傷，預(yù)防直腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌和皮膚癌，降低血液中膽固醇的含量，預(yù)防血清脂質(zhì)過(guò)氧化和心腦血管疾病[4-10]。其他種類(lèi)的類(lèi)胡蘿卜素（包括β-胡蘿卜素）還未發(fā)現(xiàn)有顯著預(yù)防癌癥和心腦血管疾病的功能[11-12]。番茄紅素作為一種優(yōu)良的抗氧劑，已被廣泛運(yùn)用于食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域，市場(chǎng)前景良好。

番茄紅素的分子結(jié)構(gòu)式[13]：

用化學(xué)合成方法制備的番茄紅素由于副產(chǎn)物多，食品安全風(fēng)險(xiǎn)大，其市場(chǎng)前景局限性較大[14]。因此，天然的番茄紅素市場(chǎng)前景被看好，正成為食品添加劑、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[15]。目前，天然番茄紅素的制備途徑主要有兩個(gè)：一是從番茄組織中提取；二是通過(guò)微生物發(fā)酵生物合成。番茄中番茄紅素含量低，約占番茄干物質(zhì)的0.05%～0.10%[16]。番茄資源短缺以及番茄中番茄紅素含量不穩(wěn)定都會(huì)嚴(yán)重影響從番茄中連續(xù)工業(yè)化提取番茄紅素的要求。用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)番茄紅素，突破了番茄資源短缺和番茄紅素品質(zhì)不穩(wěn)定的限制，是最具工業(yè)化前景的制備天然番茄紅素的有效方法。番茄紅素的天然資源包括水果、蔬菜和微生物。微生物發(fā)酵的方法比從水果和蔬菜中提取的方法，在生產(chǎn)天然番茄紅素方面優(yōu)勢(shì)突出[17]。

1 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素

用改造了代謝途徑的微生物生產(chǎn)有益的類(lèi)胡蘿卜素是有希望取代植物細(xì)胞提取高效生產(chǎn)天然類(lèi)胡蘿卜素的良好方法。HARADA H等[18]描述了用導(dǎo)入了外源甲羥戊酸途徑的大腸桿菌高效合成類(lèi)胡蘿卜素的方法。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙酰乙酸鋰，具有番茄紅素合成質(zhì)粒的重組大腸桿菌中番茄紅素的含量能達(dá)到12.5 mg/g，番茄紅素的含量比不添加乙酰乙酸鋰的對(duì)照組增加了11.8倍?；蚬こ叹瓴环€(wěn)定，需要持續(xù)的選擇壓力才能保持質(zhì)粒的穩(wěn)定。CHEN Y Y等[19]克服了這個(gè)不足，構(gòu)建了不攜帶質(zhì)粒和抗性標(biāo)記的能合成番茄紅素的重組大腸桿菌。重組菌株通過(guò)三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化獲得了基因高拷貝表達(dá)系統(tǒng)。即使發(fā)酵過(guò)程缺乏選擇試劑，工程菌株仍表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。用T5啟動(dòng)子替換大腸桿菌固有的appY啟動(dòng)子，并且敲除了iclR基因的大腸桿菌，其番茄紅素的合成能力進(jìn)一步得到提高，番茄紅素的含量達(dá)到33.43 mg/g。ZHOU Y等[20]在敲除了6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因zwf 的大腸桿菌中，進(jìn)一步上調(diào)甲羥戊酸途徑限速酶基因idi（克隆異戊烯二磷酸異構(gòu)酶）和dxs（克隆1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶）的表達(dá)，增加了番茄紅素的含量，番茄紅素的含量達(dá)到了6.85～7.55 mg/g。SUN T等[21]敲除了生產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌CAR001中的玉米黃素葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因crtX和番茄紅素環(huán)化酶基因crtY；調(diào)控α酮戊二酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和轉(zhuǎn)醛醇酶B的表達(dá)，增加還原型輔酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的供應(yīng)；調(diào)控1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs、異戊烯二磷酸異構(gòu)酶基因idi和crt 基因操縱子的表達(dá)。分批發(fā)酵時(shí)，優(yōu)化后的菌株LYC010，其番茄紅素的含量達(dá)到50.6 mg/g。ZHU F等[22]研究了定向改造甲羥戊酸途徑過(guò)量合成法尼烯，構(gòu)建了番茄紅素生產(chǎn)重組大腸桿菌L3，在2.5 L發(fā)酵液分批發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到1.44 g/L，當(dāng)發(fā)酵規(guī)模擴(kuò)大到100 L時(shí)，發(fā)酵32 h，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到1.23 g/L，番茄紅素含量達(dá)到34.3 mg/g，番茄紅素最大的生產(chǎn)效率達(dá)到74.5 mg/（L·h），且重組菌株L3容易放大生產(chǎn)，有希望取代番茄紅素傳統(tǒng)的生產(chǎn)菌株三孢布拉霉工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。KIM Y S等[23]用葡萄糖和L-阿拉伯糖作為重組大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素的主要碳源甘油的輔助碳源，能有效促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和番茄紅素的生物合成，研究表明，在補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中，添加10 g/L和7.5 g/L的葡萄糖和L-阿拉伯糖，生物量達(dá)到42 g/L，番茄紅素的含量達(dá)到了32 mg/g，分別比甘油作為單一碳源時(shí)提高了3.9和1.9倍。ZHANG T C等[24]研究表明，重組大腸桿菌在添加了6 g/L果糖的溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，能有效增加番茄紅素的產(chǎn)量，而葡萄糖作用很小，在250 mL三角瓶中，發(fā)酵24 h，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到1 050 mg/L。

2 三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）菌體屬于接合菌門(mén)、接合菌綱、毛霉目、笄霉科、布拉霉屬[25]，其生長(zhǎng)的過(guò)程表現(xiàn)為菌絲延長(zhǎng)以及細(xì)胞核裂殖增多。在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，首先形成營(yíng)養(yǎng)菌絲和氣生菌絲，最后生成菌苔，并萌發(fā)出孢子；在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，菌絲體會(huì)互相纏繞，最后形成菌絲球。三孢布拉霉菌體是異宗的接合菌，有正菌和負(fù)菌兩種單性菌株。正菌和負(fù)菌按照1∶1～1∶10的比例混合發(fā)酵生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素。三孢布拉霉菌體中類(lèi)胡蘿卜素的成分少，幾乎僅能生成β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素以及番茄紅素，是目前唯一能夠用來(lái)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素和番茄紅素的微生物[26-28]，其中以β-胡蘿卜素為主，通常能達(dá)到85%以上。

為了生產(chǎn)高純度的番茄紅素，三孢布拉霉菌體中的番茄紅素環(huán)化酶活性需完全抑制。因此番茄紅素環(huán)化酶抑制劑的抑制效果是用三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)高品質(zhì)番茄紅素的關(guān)鍵。番茄紅素環(huán)化酶抑制劑主要有咪唑類(lèi)化合物，吡啶類(lèi)化合物物以及吖嗪類(lèi)化合物[26]。根據(jù)已有的研究報(bào)道，常用的環(huán)化酶抑制劑有咪唑、吡啶、哌啶、煙酸、三乙胺和肌酐[29]。CHOUDHARI S M等[30]研究了用不同質(zhì)量濃度（100 mg/L、500 mg/L、750 mg/L、1 000 mg/L）的咪唑、哌啶、三乙胺、吡啶、胡椒基丁醚、煙酸和肌酐用作環(huán)化酶抑制劑來(lái)生產(chǎn)番茄紅素。其研究結(jié)果表明，用500 mg/L的哌啶作為環(huán)化酶抑制劑，番茄紅素的純度能接近95%，抑制效果良好。PEGKLIDOU K等[31]用2-甲基咪唑作為環(huán)化酶抑制劑，菌體生長(zhǎng)達(dá)到平衡期時(shí)，培養(yǎng)基中添加50 mg/L的2-甲基咪唑，番茄紅素的純度能達(dá)到94%。優(yōu)良的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑需具備以下幾個(gè)特征：用量少，抑制效果好，水溶性好，能降解。WANG H B等[32]用300 mg/L的2-異丙基咪唑，能完全抑制番茄紅素環(huán)化酶的活性，類(lèi)胡蘿卜素中番茄紅素的含量能達(dá)到96%，2-異丙基咪唑?yàn)樗苄?，易從番茄紅素中水洗分離，食品安全性高。2-異丙基咪唑可能會(huì)被活性污泥中假單胞菌降解，環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)低。XU F等[33]在三孢布拉霉菌體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為1%的正己烷和正十二烷作為氧載體，番茄紅素產(chǎn)量分別提高了51%和78%，并且正十二烷和乳化劑司班-20一起使用效果更好。輔酶Q和麥角固醇的生物合成是番茄紅素合成途徑的兩個(gè)主要代謝支流[34]。輔酶Q和麥角固醇的合成會(huì)降低番茄紅素的合成能力，進(jìn)而減小番茄紅素的產(chǎn)量，抑制輔酶Q和麥角固醇的生物合成能增加番茄紅素的產(chǎn)量。SUN Y等[35]分別用0.7 mg/L鹽酸特比萘芬和30 mg/L酮康唑分別作為麥角固醇生物合成的抑制劑，番茄紅素的產(chǎn)量分別增加了23%和277%。SHI Y等[36-37]研究了在三孢布拉霉菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加異戊烯基化合物和代謝前體來(lái)提高番茄紅素的產(chǎn)量，研究結(jié)果表明，發(fā)酵42 h后，發(fā)酵液中添加質(zhì)量濃度為42 mg/L的香葉醇效果最佳，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到578 mg/L，比未添加香葉醇的對(duì)照組提高了62%。

3 結(jié)論與展望

用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。由于重組大腸桿菌中導(dǎo)入了外源的甲羥戊酸途徑和番茄紅素合成酶相關(guān)基因，發(fā)酵培養(yǎng)基中需要持續(xù)的選擇壓力，以免外源質(zhì)粒的丟失，重組大腸桿菌合成番茄紅素的穩(wěn)定性較差。但用重組大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素也有顯著的優(yōu)勢(shì)，發(fā)酵周期短，48 h內(nèi)即可完成發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基價(jià)格低廉，發(fā)酵成本低。因此，提高重組大腸桿菌合成番茄紅素的穩(wěn)定性是用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的研究重點(diǎn)。用三孢布拉霉菌體發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素，菌體合成番茄紅素穩(wěn)定性好，食品安全性較大腸桿菌高，但發(fā)酵周期長(zhǎng)，需120 h以上才能完成發(fā)酵，耗氧量高，發(fā)酵培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，發(fā)酵成本高。因此，降低發(fā)酵成本是用三孢布拉霉菌體發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的研究重點(diǎn)。

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