繆成鵬，張 暉，楊曉雁，潘 婷，尹玉玲，惠竹梅*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.山西戎子酒莊有限公司，山西 鄉(xiāng)寧 042100）

氮是釀酒葡萄（Vitis viniferaL.）從土壤中獲取的主要營(yíng)養(yǎng)素，在釀酒葡萄和發(fā)酵微生物的生物功能和進(jìn)程中起著重要的作用[1-2]，在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母優(yōu)先利用的氮源為銨態(tài)氮、游離α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，被稱(chēng)為酵母可同化氮素（yeast assimilable nitrogen，YAN）。銨態(tài)氮是酵母可同化氮素的主要成分，是釀酒酵母優(yōu)先利用的無(wú)機(jī)氮源；而葡萄汁中的游離氨基酸是葡萄酒發(fā)酵香氣成分的主要前體物，其含量直接影響葡萄酒中高級(jí)醇、酯類(lèi)及揮發(fā)性脂肪酸等香氣成分的形成。葡萄汁可同化氮素的組成及含量與品種、生態(tài)條件、施肥、土壤管理、果實(shí)成熟度等密切相關(guān)。葡萄園氮肥的施用和管理，對(duì)葡萄和葡萄酒中的成分有潛在的影響[3-5]，另外，葡萄果漿中氮含量和葡萄醪添加可同化氮對(duì)酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)和香氣物質(zhì)的組成有重要的影響[6-8]。

國(guó)外關(guān)于葡萄汁可同化氮的添加對(duì)酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、葡萄酒香氣成分及葡萄酒的質(zhì)量方面進(jìn)行了很多研究[9-12]，如TORREA D等[12]研究認(rèn)為，高級(jí)醇、支鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸乙酯含量隨葡萄汁中可同化氮含量增加而減少，而中鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸酯隨可同化氮含量增加而增加。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)可同化氮與酵母生長(zhǎng)、發(fā)酵動(dòng)力和發(fā)酵香氣物質(zhì)的研究很少，張瑾等[6]研究表明，模擬葡萄汁中可同化氮含量增加，酵母菌數(shù)量增加，發(fā)酵速率加快，高級(jí)醇和脂類(lèi)含量升高?；葜衩返萚13]研究結(jié)合前人研究成果，論述了葡萄汁可同化氮對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響。

本試驗(yàn)在山西臨汾市鄉(xiāng)寧縣戎子酒莊釀酒葡萄基地進(jìn)行，對(duì)三個(gè)葡萄園（馱腰坡、東廒北、東廒南）進(jìn)行土壤含氮量、赤霞珠葡萄及葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中可同化氮含量、葡萄酒理化指標(biāo)的檢測(cè)與分析。通過(guò)研究酵母可同化氮含量對(duì)酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及葡萄酒香氣成分等的影響，為葡萄園氮肥施用及葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中氮源的添加提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐亞種釀酒葡萄（Viti viniferaL.）品種赤霞珠（Cabernet Sauvignon）：山西臨汾市鄉(xiāng)寧縣戎子酒莊。

商業(yè)果膠酶EX、酵母D254：法國(guó)Lallemand公司；氮源NutriSTART：法國(guó)Loffort公司。

無(wú)水碳酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸氫鉀、磷酸、檸檬酸、碘、濃鹽酸，濃硫酸等（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；無(wú)水葡萄糖（分析純）：天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

銨離子氮試劑盒Megazyme Ammonia Nitrogen Assay Procedure（96 Assays per kit）、氨基酸氮試劑盒Megazyme Primary Amino Nitrogen Assay Procedure（100 Assays per kit）：愛(ài)爾蘭Megazyme International Ireland有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TP-2101型十分之一天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9146A型干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)、AUW-220D型十萬(wàn)分之一天平：日本島津公司；TG16-WSC型國(guó)產(chǎn)高速離心機(jī)：湖南湘儀科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；MDF-U73V型超低溫冰箱（-80 ℃）：日本Sanyo公司；HP-5970-5890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以山西戎子酒莊有限公司2012年?yáng)|廒北葡萄園、東廒南葡萄園、駝腰坡葡萄園的赤霞珠為研究對(duì)象。葡萄采收當(dāng)天，采集試驗(yàn)葡萄園土壤，檢測(cè)土壤全氮、硝態(tài)氮和銨離子氮；同時(shí)檢測(cè)葡萄果實(shí)中YAN含量。

葡萄采收后在相同的條件下進(jìn)行釀酒實(shí)驗(yàn)，另外，三個(gè)葡萄園中葡萄可同化氮含量最低的為東廒南，因此選作添加助劑NutriSTART對(duì)比實(shí)驗(yàn)（葡萄破碎24 h后添加，添加量100 mg/kg）。分別測(cè)定葡萄破碎后（加果膠酶前）、添加酵母前、發(fā)酵中期（比重1.050）、發(fā)酵后期（比重1.010）和分離皮渣后酒樣的銨離子氮、氨基酸態(tài)氮含量，同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中測(cè)定溫度和比重，監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程，酒精發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行葡萄酒基本理化指標(biāo)的測(cè)定。以上各階段用100 mL取樣瓶取酒樣后，在-80 ℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存待檢測(cè)。

1.3.2 干紅葡萄酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

葡萄→分選→除梗破碎→酒精發(fā)酵→皮渣分離→陳釀→成品

操作要點(diǎn)：

（1）葡萄除梗破碎過(guò)程中按照果膠酶EX（30 mg/L）、SO2（50 mg/L）添加輔料；

（2）入罐浸漬24 h后添加酵母D254，東廒南在此基礎(chǔ)上添加NutriSTART；

（3）控溫26～28 ℃進(jìn)行酒精發(fā)酵，每12 h壓帽一次，每8 h測(cè)溫度和比重一次；

（4）當(dāng)殘?zhí)牵? g/L時(shí)，進(jìn)行皮渣分離，自流汁和壓榨汁進(jìn)行混合；

（5）葡萄酒不進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸菌發(fā)酵，添加SO2（50 mg/L）后進(jìn)行陳釀。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

（1）土壤取樣

葡萄采收當(dāng)天，同時(shí)進(jìn)行土壤采樣。

土樣采集方法：同一葡萄園選取5～8個(gè)點(diǎn)，用20 cm土鉆取0～60 cm的混合土樣5～6 kg，風(fēng)干后按四邊形對(duì)角取樣1 kg，送至西北農(nóng)林科技大學(xué)檢測(cè)全氮、硝態(tài)氮和銨離子氮含量。

（2）果實(shí)理化指標(biāo)測(cè)定

在葡萄果實(shí)成熟時(shí)，2012年10月9日，每試驗(yàn)小區(qū)從葡萄行向的兩邊隨機(jī)采摘20 kg葡萄，立即帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定還原糖、總酸、pH值、總酚等理化指標(biāo)，并按照葡萄酒釀造工藝進(jìn)行釀酒實(shí)驗(yàn)。

（3）葡萄中可同化氮（YAN）含量的計(jì)算

采用試劑盒檢測(cè)氨基酸態(tài)氮和銨離子氮含量。計(jì)算公式如下：

式中：X1為氨基酸態(tài)氮含量，mg/L；V為終體積，mL；MW為氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε為氮素在波長(zhǎng)340 nm處的消光系數(shù)；d為光路距離，cm；v為樣品體積，mL。

式中：X2為銨離子氮含量，mg/L；V為終體積，mL；MW為氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε為氮素在波長(zhǎng)340 nm處的消光系數(shù)；d為光路距離，cm；v為樣品體積，mL。

可同化氮含量（mg/L）=X1＋X2

（4）土壤中全氮、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮測(cè)定方法

土壤全氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，其計(jì)算公式：

式中：V為滴定試樣時(shí)消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為滴定空白時(shí)消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；C鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；W為土壤樣品質(zhì)量，g；0.014為氮的摩爾質(zhì)量，kg/mol。

土壤硝態(tài)氮（NO3-N）含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，其計(jì)算公式如下：

土壤硝態(tài)氮含量（mg/kg）=C×25×D/m。

式中：C為回歸方程算出的NO3-N含量；25為測(cè)定液總體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為鮮土樣質(zhì)量，g。

土壤銨態(tài)氮（NH4+-N）含量測(cè)定采用氯化鉀（KCl）浸提-靛藍(lán)比色法，其計(jì)算公式如下：

土壤銨態(tài)氮（NH4+-N）含量（mg/kg）=C×V×ts/m

式中：C為顯色液銨態(tài)氮的質(zhì)量濃度，μg/kg；V為顯色液體積，mL；ts為分取倍數(shù)；m為土樣的質(zhì)量，g。

（5）葡萄酒的理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度測(cè)定GB/15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法》中的酒精蒸餾法；干浸出物采用密度瓶法；還原糖測(cè)定采用直接滴定法；總酸測(cè)定采用酸堿滴定法；揮發(fā)酸測(cè)定采用蒸餾法；二氧化硫測(cè)定采用直接碘量法。

（6）靜態(tài)頂空氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)葡萄酒中的香氣成分[15]

樣品處理：取5 mL樣品入頂空瓶，加入2 g NaCl，壓緊瓶蓋，密封。

頂空條件：進(jìn)樣環(huán)體積1 mL，樣品瓶加壓壓力138 kPa，加壓時(shí)間0.2 min，充氣時(shí)間0.2 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min。頂空平衡溫度50 ℃，頂空平衡時(shí)間45 min。

色譜條件：DB-Wax毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫采用程序升溫，60 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保留30 min，恒流1 mL/min，分流比50∶1。載氣：氦氣（He）。

質(zhì)譜條件：連接桿溫度280 ℃，電離方式采用電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓927 eV，質(zhì)譜掃描范圍50～500。

定性定量方法：葡萄酒中香氣成分利用質(zhì)譜全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據(jù)已有標(biāo)樣的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜信息、NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果以及參考相關(guān)文獻(xiàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行定性分析。各香氣成分的相對(duì)含量采用氣相色譜面積歸一化法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄園中土壤含氮量與葡萄YAN分析

本試驗(yàn)中選擇了山西戎子酒莊不同位置的三塊葡萄園，分別為馱腰坡、東廒北和東廒南，各葡萄園采集土樣后的含氮量分析結(jié)果見(jiàn)表1，各葡萄園赤霞珠葡萄果實(shí)理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)土壤養(yǎng)分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]，本產(chǎn)區(qū)試驗(yàn)葡萄園的全氮水平都＜0.05%，屬于六級(jí)水平，試驗(yàn)葡萄園需考慮氮肥的施用，同時(shí)也應(yīng)該考慮硝態(tài)氮與銨態(tài)氮的比例。

表1 不同試驗(yàn)葡萄園的土壤含氮量Table 1 Soil nitrogen content in different vineyards

表2 不同葡萄園赤霞珠葡萄果實(shí)理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon grapes in different vineyards

由表1和表2可知，土壤全氮、硝態(tài)氮含量最高的東廒南葡萄園，赤霞珠可同化氮含量最低，而銨態(tài)氮含量最高的馱腰坡赤霞珠可同化氮含量最高，銨態(tài)氮相近的東廒北和東廒南葡萄園赤霞珠可同化氮含量相近，這說(shuō)明葡萄果實(shí)可同化氮含量可能主要與土壤銨態(tài)氮含量有關(guān)。

2.2 葡萄酒釀造過(guò)程中可同化氮、溫度與比重的變化

葡萄酒釀造過(guò)程中可同化含量變化見(jiàn)圖1，溫度與比重變化見(jiàn)圖2。

圖1 葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中可同化氮含量的變化Fig.1 Change of assimilable nitrogen content during wine fermentation

由圖1可知，不同葡萄園的赤霞珠葡萄汁可同化氮的含量不同，均超過(guò)了150 mg/L，這些都遠(yuǎn)高于采收前葡萄中可同化氮的含量，說(shuō)明葡萄果皮中的可同化氮浸漬到葡萄汁中，可同化氮含量保證了發(fā)酵順利進(jìn)行。如果需要添加可同化氮時(shí)，應(yīng)以此時(shí)測(cè)定的可同化氮含量為依據(jù)，避免添加過(guò)量。發(fā)酵中酵母對(duì)可同化氮的利用主要集中在發(fā)酵旺盛之前階段，當(dāng)比重降至約1.050以后，葡萄酒中檢測(cè)不到可同化氮。說(shuō)明對(duì)于YAN含量較低的葡萄汁，如果需要給酵母補(bǔ)充氮源，在此階段之前比較適宜。

圖2 葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中溫度比重的變化Fig.2 Change of temperature and density during wine fermentation

由圖2可知，不同葡萄園的赤霞珠含糖量基本一致，并提供相同的發(fā)酵條件。三個(gè)不同葡萄園的赤霞珠葡萄酒發(fā)酵溫度變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵過(guò)程中酒體比重的變化趨勢(shì)也基本一致。因此，圖1中可同化氮含量保證了圖2中發(fā)酵順利的完成。東廒南助劑赤霞珠比重下降速率高于東廒南，說(shuō)明東廒南赤霞珠添加氮源后，發(fā)酵速率增加。

2.3 葡萄酒理化指標(biāo)分析

酒樣結(jié)束酒精發(fā)酵后，經(jīng)過(guò)皮渣分離，自流汁和壓榨汁混合后裝入1.5 L的酒瓶中進(jìn)行陳釀，按游離二氧化硫30 mg/L進(jìn)行添加。陳釀期間取樣檢測(cè)理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同葡萄園赤霞珠葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of red wine produced by Cabernet Sauvignon grapes in different vineyards

由表3可知，葡萄酒發(fā)酵正常，基本指標(biāo)均達(dá)國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求，葡萄酒理化指標(biāo)沒(méi)有明顯差異。在添加助劑的實(shí)驗(yàn)中，東廒南助劑表現(xiàn)出較低的酒精度，但葡萄酒的干浸出物含量增加。

2.4 葡萄酒香氣成分分析

采用GC-MS法對(duì)各葡萄園的葡萄酒進(jìn)行香氣成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，香氣成分相對(duì)含量見(jiàn)表4。

圖3 馱腰坡(A)、東廒北(B)、東廒南(C)及東廒南助劑(D)葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of aromatic components of Tuoyaopo (A),Dongaobei (B),Dongaonan (C) and Dongaonan NutriSTART (D) wines

由圖3及表4可知，葡萄酒中的酯類(lèi)主要為丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、葵酸乙酯等。其中，丁酸乙酯能帶來(lái)酸果香、草莓香，己酸乙酯帶來(lái)青蘋(píng)果、草莓香和茴香，辛酸乙酯賦予酒果香和茴香味；各葡萄酒中的醇類(lèi)主要有正-丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇和苯乙醇等。其中，正-丙醇能使酒更清爽，2-甲基丙醇具有苦杏仁味的特點(diǎn)，3-甲基-1-丁醇帶給酒奶酪味，而正己醇和苯乙醇分別賦予酒吐司味和花香[13-14]。

表4 葡萄酒中香氣成分相對(duì)含量Table 4 Relative contents of aromatic components in wine

酯類(lèi)和醇類(lèi)相對(duì)含量表明，馱腰坡＞東廒南助劑＞東廒北＞東廒南，這與葡萄汁中可同化氮含量呈正相關(guān)。張瑾等[6]研究表明，模擬葡萄汁中可同化氮含量增加，酵母菌數(shù)量增加，發(fā)酵速率加快，高級(jí)醇和脂類(lèi)含量升高。本試驗(yàn)結(jié)論與其研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中葡萄園的全氮水平都＜0.05%，屬于六級(jí)水平。土壤全氮、硝態(tài)氮含量最高的東廒南葡萄園，赤霞珠可同化氮含量最低，而銨態(tài)氮含量最高的馱腰坡赤霞珠可同化氮含量最高，銨態(tài)氮相近的東廒北和東廒南葡萄園赤霞珠可同化氮含量相近，這說(shuō)明葡萄果實(shí)可同化氮含量可能主要與土壤銨態(tài)氮含量有關(guān)。葡萄酒中酯類(lèi)和醇類(lèi)相對(duì)含量由高到低依次為：馱腰坡＞東廒南助劑＞東廒北＞東廒南，這與葡萄汁中可同化氮含量呈正相關(guān)。因此，土壤中的銨態(tài)氮含量，通過(guò)對(duì)可同化氮含量直接影響，間接影響了葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量，這將對(duì)葡萄園施氮等管理對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響起到一定的指導(dǎo)作用。

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