張璐 李煥娟 朱乃亮 彭平 孫道涵 孫雅姝 遲蕾 姜艷艷 石任兵

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott 的干燥根莖，具芳香化濕，開竅寧神等功效，用于治療癲癇、驚厥、健忘、老年癡呆等證。其中，2010 版《中華人民共和國藥典》(一部)收錄的石菖蒲含量測定方法為測定石菖蒲中總揮發(fā)油的量［1］，以揮發(fā)油含量表征石菖蒲的質(zhì)量。在研究石菖蒲藥物中，本課題組發(fā)現(xiàn)石菖蒲藥物成分苯丙素類與酚類相互作用與其鎮(zhèn)靜、抗抑郁藥效的關(guān)聯(lián)性［2-6］，并建立了有效物質(zhì)分離富集方法［7-8］。

在運用本課題組建立的藥代動力學—藥效動力學—藥物成分相互作用關(guān)聯(lián)分析方法(pharmacokinetics-pharmacodynamics-drug interactions，PK-PDDI)研究經(jīng)方遠志湯、開心散(遠志、石菖蒲、茯苓、人參)以及組成單味藥，抗癡呆、抗抑郁藥物體系時，筆者發(fā)現(xiàn)石菖蒲芳香酸類與苯丙素類同為藥物體系組成成分。中藥化學成分的有效性與其質(zhì)量性有關(guān)，即與中藥化學成分的類型以及存在的量、組成比例等有關(guān)［9-11］。

本文報道運用課題組所建立的基于藥物體系的中藥質(zhì)量評價模式［12］，對石菖蒲進行質(zhì)量評價與控制。即基于藥物體系的石菖蒲芳香酸類(原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸之和)與苯丙素類(β-細辛醚、α-細辛醚之和)有效指標性成分的含量測定，關(guān)注有效指標性成分的含量及組成比例，并與有效性確切的基準飲片進行關(guān)聯(lián)度分析比較與質(zhì)量綜合考量，以確定其飲片質(zhì)量優(yōu)良度，為石菖蒲的有效應用提供科學依據(jù)，亦為有關(guān)藥物的質(zhì)量保障提供支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀，Empower Pro 軟件系統(tǒng)，2998 二極管陣列檢測器;METTLER-AE240型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

原兒茶酸(批號121009，純度≥98%)、香草酸(批號120915，純度≥98%)、α-細辛醚(批號100298-201203，純度100%)均購自北京方程生物科技有限公司，2，4，5-三甲氧基苯甲酸(批號20130816，純度97%)購自國藥集團化學試劑有限公司，β-細辛醚(批號00011017-T9K，純度95%)購自天津一方科技有限公司，乙腈(色譜級，F(xiàn)isher Scientific 公司)，甲醇(分析純，北京化工廠)，乙酸(分析純，北京化學試劑公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，其余試劑均為分析純。

15 批石菖蒲飲片購自于北京同仁堂藥材有限責任公司及北京金象大藥房，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學生藥系劉春生教授鑒定為石菖蒲Acorus tatarinowii Schott 的干燥根莖，有關(guān)樣品進行編號后存放在北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥化學系。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD (C18)液相色譜柱(250 mm×4.6 mm × 5 μm)，流動相乙腈(A)-0.2%乙酸水(B)，洗脫梯度(0 ～5 分鐘，0% ～2%A;5 ～10 分鐘，2% ～5% A;10 ～11 分鐘，5% ～6%A;11 ～14 分鐘，6% ～8%A;14 ～17 分鐘，8%A;17 ～27 分鐘，8% ～10% A;27 ～40 分鐘，10% ～13%A;40 ～50 分鐘，13% ～15%A;50 ～52 分鐘，15% ～30%A;52 ～55 分鐘，30% ～45%A;55 ～60分鐘，45% ～47%A;60 ～67 分鐘，47%A;67 ～70 分鐘，47% ～100%A)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長256 nm，進樣量10 μL。

上述色譜條件下，石菖蒲對照品及飲片的HPLC 譜圖見圖1。采用二極管陣列檢測器在190 ～400 nm 全波長掃描，結(jié)果顯示5 種有效指標性成分在256 nm 波長下有最大吸收且與其他色譜峰分離度良好，故選用256 nm 為檢測波長，確保待測成分均有最高的檢測靈敏度。

圖1 石菖蒲供試品(A)及對照品(B)的HPLC 色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

分別取上述5 種對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1 mL 含有原兒茶酸19.9 μg、香草酸19.1 μg、2，4，5-三甲氧基苯甲酸31.2 μg、β-細辛醚652.8 μg、α-細辛醚104.6 μg 的對照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取石菖蒲飲片粉碎，過四號篩，稱取約2 g，精密稱定，置于100 mL 圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，加熱回流提取60 分鐘，趁熱過濾，提取3 次，合并濾液，回收溶劑至干，殘渣加70%甲醇使溶解，定容至10 mL，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

將“2.2”項下對照品混合溶液進樣1 μL，4 μL，8 μL，16 μL，32 μL，48 μL，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

對小區(qū)邊界及住宅周邊進行智能監(jiān)控，檢測入侵、盜搶、翻墻等異常行為并自動報警，第一時間發(fā)現(xiàn)危險情況，保障小區(qū)/校園安全。

表1 5 種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=6)

2.5 精密度試驗

取“2.3”項下同一石菖蒲樣品溶液，連續(xù)進樣6次，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細辛醚、α-細辛醚的峰面積的RSD 分別為2.97%，2.47%，1.40%，0.68%，0.67%，精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一石菖蒲飲片樣品，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細辛醚、α-細辛醚的平均含量分別為0.0026%、0.0015%、0.0016%、0.6897%、0.0901%，RSD 分別為2.83%，0.62%，1.53%，0.85%，0.55%，重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”項下同一供試品溶液，于室溫下放置，分別于0 小時，2 小時，4 小時，8 小時，12 小時，24小時進樣，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細辛醚、α-細辛醚的峰面積的RSD 分別為2.83%，2.04%，2.17%，0.38%，0.61%，供試品溶液在24 小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

稱取同一石菖蒲樣品粉末(過四號篩)約1 g 共6 份，精密稱定，加入對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細辛醚、α-細辛醚的加樣回收率分別為99.59%、99.14%、100.15%、100.33%、100.14%，RSD 分別為2.97%、2.93%、1.72%、0.51%、1.44%，加樣回收率合格，說明本方法準確、可靠，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 石菖蒲質(zhì)量表征

2.9.1 基于有效指標性成分含量的質(zhì)量表征 取15 個石菖蒲飲片樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每個平行制備3 份，照“2.1”項色譜條件進樣，測定原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細辛醚、α-細辛醚的含量，對石菖蒲飲片中有效指標性成分含量進行全面表征，結(jié)果見表3。

2.9.2 基于有效指標性成分含量相對比值的質(zhì)量表征 以藥物體系中關(guān)鍵有效指標性成分香草酸的含量為基準，將15 個石菖蒲飲片樣品中各有效指標性成分含量與香草酸含量的相對比值予以表征，結(jié)果見表4。

2.10 石菖蒲質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析

2.10.1 基于與基準飲片有效指標性成分含量相對比值的質(zhì)量表征的關(guān)聯(lián)分析 基于“2.9.1”項下表3進行15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析，如表3所示，15 個石菖蒲飲片中各有效指標性成分含量相差較大，并計算最高比值與最低比值的比，以反映各飲片中有效指標性成分含量的差異。原兒茶酸含量最大相差約1.84 倍，含量從高到低排序為:樣品9＞3＞7＞14＞2＞6＞15＞11＞12＞1＞10＞8＞4＞5＞13;香草酸含量最大相差約2.0 倍，含量從高到低排序為:樣品11＞12＞1＞15＞13＞10＞7＞9＞3＞14＞2＞6＞8＞5＞4;2，4，5-三甲氧基苯甲酸含量最大相差約5.2 倍，含量從高到低排序為:樣品1＞3＞9＞14＞15＞6＞7＞5＞12＞2＞10＞4＞13＞11＞8;芳香酸類含量和最大相差約1.81倍，含量從高到底排序為:樣品9＞1＞3＞14＞15＞7＞6＞12＞11＞2＞10＞5＞13＞4＞8;β-細辛醚含量最大相差約3.5 倍，含量從高到低排序為:樣品12＞1＞4＞11＞9＞6＞7＞15＞14＞10＞5＞13＞3＞2＞8;α-細辛醚含量最大相差約10.8 倍，含量從高到低排序為:樣品12＞9＞14＞6＞1＞15＞5＞7＞8＞10＞3＞13＞2＞4＞11;苯丙素類含量和最大相差約3.8 倍，含量從高到底排序為:樣品12＞9＞6＞14＞1＞7＞4＞15＞11＞5＞10＞13＞3＞2＞8。

表3 基于有效指標性成分含量的15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量表征(mg/g，n=3)

可見，在15 個石菖蒲飲片樣品中有效指標性成分含量差異性:α-細辛醚(10.8 倍)＞2，4，5-三甲氧基苯甲酸(5.2 倍)＞苯丙素類含量和(3.8 倍)＞β-細辛醚(3.5 倍)＞香草酸(2 倍)＞原兒茶酸(1.84倍)＞芳香酸類含量和(1.81 倍);而基于原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、芳香酸類含量和、β-細辛醚、α-細辛醚、苯丙素類含量和進行綜合考量，樣品1、6、9、12、14 中有效指標性成分含量總體高于有效性確切的基準飲片樣品15［13］，樣品7 中有效指標性成分含量與樣品15 接近。

2.10.2 基于與基準飲片有效指標性成分含量相對比值的比值質(zhì)量表征的關(guān)聯(lián)分析 將“2.9.2”項下表4以樣品15 為基準，將15 個石菖蒲飲片中有效指標性成分含量相對比值與基準飲片樣品15 的相對比值的比值進行關(guān)聯(lián)分析得表5、圖2。

表4 基于有效指標性成分含量相對比值的15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量表征

圖2中不同顏色的矩形條代表各飲片中有效指標性成分含量相對比值與樣品15 對應成分含量相對比值的比值，矩形條大小與樣品15 中相同顏色的矩形條大小越相近，代表該飲片有效指標性成分含量比值與樣品15 越接近，即質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)密切?？梢钥闯觯瑯悠?、5、7 與15 質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)密切。以樣品15 為基準，其他樣品與其相對比值的比值差值的絕對值之和，即非關(guān)聯(lián)系數(shù)δ;非關(guān)聯(lián)系數(shù)與有效指標性成分的數(shù)目的比值，即非關(guān)聯(lián)度，進而得到關(guān)聯(lián)度，以反映飲片質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)性，得表5。

由表5可知，關(guān)聯(lián)度由高到低排序為樣品15(0/100%)＞7 (0.8573/87.75%)＞1 (1.1368/83.76%)＞10 (1.1428/83.67%)＞2 (1.4900/78.71%)＞13 (1.8837/73.09%)＞5 (2.0236/71.09%)＞3 (2.0273/71.04%)＞8 (2.1988/68.59%)＞11 (2.1990/68.59%)＞12 (2.5758/63.20%)＞4 (2.9056/58.49%)＞14 (3.3258/52.49%)＞9 (3.8515/44.98%)＞6 (4.1389/40.87%)，即樣品7、1、10 與基準樣品15 質(zhì)量關(guān)聯(lián)性最高，而樣品6、9 與基準樣品15 質(zhì)量關(guān)聯(lián)性相差較大。

表5 15 個石菖蒲飲片樣品關(guān)聯(lián)度表征

圖2 15 個石菖蒲飲片中各有效指標性成分含量相對比值與基準飲片樣品15 對應成分含量相對比值的比值

3 結(jié)論

本文基于藥物體系質(zhì)量評價模式，對石菖蒲進行質(zhì)量表征及關(guān)聯(lián)分析研究，確定出樣品1、6、9、12、14 有效指標性成分含量總體高于基準樣品15，樣品7 有效指標性成分含量與基準樣品15 接近。其中樣品7、1、10 與基準樣品15 關(guān)聯(lián)性最高，綜合評價得出樣品1 及樣品7 質(zhì)量優(yōu)良度居前，其次為樣品6、9、12、14、10。

中藥飲片質(zhì)量與其所含有效化學成分類型及存在的量、組成比例等有關(guān)。本文在自然藥學觀相關(guān)理論的指導下，基于藥物體系組成成分的發(fā)現(xiàn)，運用有關(guān)中藥質(zhì)量評價模式，對15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量進行表征，并以具有確切藥效的樣品15 為基準，進行質(zhì)量關(guān)聯(lián)度分析比較，綜合精準評價出石菖蒲飲片質(zhì)量的優(yōu)良度。即綜合考量了石菖蒲應用有效性及質(zhì)量關(guān)聯(lián)性，從而為石菖蒲資源篩選及其藥物的原料質(zhì)量控制及應用提供了依據(jù)，亦為中藥藥材及其飲片的質(zhì)量評價提供了研究借鑒。

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