周慶峰，劉純慧，王洪新

(1.商丘師范學(xué)院生物技術(shù)藥物重點實驗室，河南商丘　476000;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南　250100; 3.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州　121001)

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海膽黃多糖SEP抑制高糖高胰島素誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細胞肥大

周慶峰1，劉純慧2，王洪新3

(1.商丘師范學(xué)院生物技術(shù)藥物重點實驗室，河南商丘476000;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250100; 3.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州121001)

摘要:目的觀察海膽黃多糖SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細胞的影響，并初步探索其作用機制。方法利用高糖高胰島素模擬糖尿病機體微環(huán)境誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞肥大模型，選擇不同劑量海膽黃多糖SEP分組給藥處理后，采用Lowrys法檢測心肌細胞蛋白質(zhì)含量;利用計算機圖像分析系統(tǒng)檢測心肌細胞表面積變化;采用RT-PCR法檢測給藥前后心肌細胞ANF和PPAR-α mRNA表達變化。結(jié)果與正常對照組相比，高糖高胰島素組蛋白含量、細胞表面積、ANF和PPAR-α mRNA表達均明顯增加;與高糖高胰島素組相比，低、中、高給藥組劑量依賴性降低了高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細胞的蛋白含量、細胞表面積、以及ANF和PPAR-α mRNA表達。結(jié)論SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的乳鼠心肌細胞肥大具有一定的抑制作用，PPAR-α信號通路可能參與了這一過程。

關(guān)鍵詞:心肌細胞;肥大;乳鼠;高糖高胰島素;多糖;SEP

糖尿病心肌病主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大和纖維化，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，危害性大［1］。海膽黃多糖(polysaccharide from the eggs of S.nud?us，SEP)是從光棘球海膽的卵中分離到的一種水溶性多糖，具有明顯促脾淋巴細胞增殖和抗腫瘤作用［2－3］。已有研究表明，黃芪多糖、人參多糖等多糖類藥物可產(chǎn)生抑制心肌細胞肥大作用［4－5］，然而海膽黃多糖SEP是否對糖尿病誘導(dǎo)的心肌細胞肥大也具有保護作用，目前仍尚不明確。

糖尿病患者長期處于高糖和高胰島素內(nèi)環(huán)境，可直接促進心肌細胞蛋白的合成進而誘發(fā)心肌細胞肥大，故采用高糖和高胰島素處理體外培養(yǎng)的心肌細胞，可在一定程度上模擬糖尿病心肌肥大的病理環(huán)境［6］。因此，本研究首先采用高糖高胰島素體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞來誘導(dǎo)心肌細胞肥大，進而采用海膽黃多糖SEP處理高糖高胰島素培養(yǎng)下所誘導(dǎo)的肥大心肌細胞，觀察海膽黃多糖SEP對肥大心肌細胞的蛋白含量、細胞表面積以及心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF) mRNA表達的影響，而ANF是心肌細胞肥大的標志性因子［7］。

最新研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體-α (peroxisome pro1iferator-activated receptors，PPAR-α)參與了高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大過程［8］，因此，本研究采用定量PCR技術(shù)分析SEP對RRAR-α mRNA表達的影響，初步探索SEP影響心肌細胞肥大的可能信號通路。

1　材料與方法

1.1實驗動物出生2 d的SD大鼠乳鼠，♀♂不拘，由商丘師范學(xué)院生科院提供。

1.2藥品與試劑Trypsin、SDS、DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖、胰島素均為Sigma公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;小牛血清為杭州四季青生物材料研究所產(chǎn)品; TRIozol Reagent為寶生物工程有限公司產(chǎn)品;引物合成由南京金斯瑞上生物技術(shù)有限公司完成，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3海膽黃多糖SEP的制備海膽黃多糖多糖SEP的制備按照劉純慧等［8］研究方法完成。

1.4體外乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)取出生2－3 d 的SD大鼠乳鼠，無菌條件下開胸取出心臟，DHanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，加入0.6 g·L－1胰蛋白酶消化細胞，根據(jù)差速貼壁法獲得較純的心肌細胞，以1×108·L－1的密度送入通以體積分數(shù)為0.05 CO2及0.95空氣的二氧化碳孵箱中培養(yǎng)［9］。

1.5實驗分組及給藥方法常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞48 h后，換液為無血清的DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板上的細胞分為6組，換培養(yǎng)基的同時給藥，每組給藥如下:第1組為正常對照組;第2組為給予25.5 mmol·L－1葡萄糖和0.1μmol·L－1胰島素的高糖高胰島素組;第3組為在第2組基礎(chǔ)上加入1 mg·L－1的低劑量SEP組;第4組為10 mg·L－1的中劑量SEP 組;第5組為100 mg·L－1的高劑量SEP組;第6組為100 mg·L－1的高劑量黃芪多糖(APS)組;給藥48 h后 進行各項指標的測定。

1.6培養(yǎng)心肌細胞蛋白質(zhì)含量的測定吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks液快速沖洗3次后，加入10 g·L－1SDS (十二烷基硫酸鈉) 0.5 mL溶解細胞，根據(jù)計數(shù)，每孔細胞數(shù)約為1×105個，Lowrys法測每孔細胞蛋白質(zhì)含量。

1.7培養(yǎng)心肌細胞表面積測量采用計算機CIAS大恒細胞圖像分析系統(tǒng)(400×)測量單個細胞的直徑，進而計算出細胞的表面積。每孔隨機選擇7個視野，每個視野測10個細胞。

1.8ANF和PPAR-α mRNA的表達檢測分析心肌細胞肥大通常伴有ANF的表達，因此本研究通過RT-PCR法檢測心肌細胞肥大時ANF mRNA的表達，作為反映觀測心肌細胞肥大的參考指標［10］。參照文獻及GenBank中大鼠相應(yīng)基因序列，采用TRIzol提取心肌細胞總RNA，按說明書操作進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物分析，以β-actin為內(nèi)參，采用ANF和PPAR-αmRNA與β-actin吸光度比值變化來衡量SEP對目標基因mRNA表達的影響，比值越高，代表基因表達量越高。

2　結(jié)果

2.1SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細胞的蛋白含量的影響各組間分別加入不同影響因素處理48 h后，用Lowrys法測定每孔細胞的OD值。與正常對照組相比，高糖高胰島素組心肌細胞蛋白含量增加了38.8% (P＜0.01)，與高糖高胰島素組相比，SEP低、中、高劑量組心肌細胞蛋白含量分別減少了5.6% (P＜0.05)、13.8% (P＜0.01)和15.5%(P＜0.01)，差異具有顯著性，表明不同劑量組SEP均能有效減少肥大心肌細胞的蛋白含量，隨著給藥劑量的增加，SEP抑制肥大心肌細胞蛋白含量的能力逐步增強，APS處理組與高糖高胰島素組相比，心肌細胞蛋白含量減少了24.0%(P＜0.01)，差異亦有顯著性。與同劑量SEP組相比，APS給藥組的蛋白含量減少了10.1%，抑制效果更為明顯(P ＜0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of SEP on cellular protein content of hypertrophic heartcells of neonatal rats induced with high glucose and high insulin

2.2SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細胞的細胞表面積的影響各組間分別加入不同影響因素處理48 h后，用圖像處理系統(tǒng)測定心肌細胞的表面積。結(jié)果表明，與正常對照組相比，高糖高胰島素組心肌細胞表面積增加了39.9 % (P＜0.01) ;與高糖高胰島素組相比，1、10、100 mg·L－1劑量SEP給藥組的心肌細胞表面積分別減少了6.2 %、8.5 %和9.7 %(P＜0.01)，差異有顯著性; APS處理組與高糖高胰島素組相比，心肌細胞表面積減少了15.3% (P＜0.01)，差異亦有顯著性。以上數(shù)值表明各劑量組SEP均能有效減少肥大心肌細胞的表面積。與同劑量SEP給藥組相比，100 mg·L－1APS給藥組的蛋白含量減少了6.2%，抑制能力更為明顯，P ＜0.01，見Tab 2。

Tab 2 Effects of SEP on cellular volume of hypertrophic heart cells of neonatal rats induced with high glucose and high insulin

2.3SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細胞ANF mRNA表達的影響在細胞培養(yǎng)液中加入不同劑量SEP和黃芪多糖作用48 h后。結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖高胰島素組ANF/β-actin吸光度比值升高了83%，表明ANF mRNA表達量明顯升高。同時，與高糖高胰島素組相比，不同濃度SEP給藥組ANF/β-actin吸光度比值分別減少了15%、37%和39% (P＜0.01)，表明隨著給藥劑量的增加，1、10、100 mg·L－1劑量SEP給藥組抑制ANF mRNA表達效果逐漸升高(Fig 1)。

Fig 1 Effect of SEP on expression ANF mRNA of hypertrophic heart cells of neonatal rats inducedwith high glucose and high insulin

2.4SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細胞PPAR-α mRNA表達的影響在細胞培養(yǎng)液中加入不同劑量SEP和黃芪多糖作用48 h后，結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞PPAR-α mRNA/β-actin吸光度比值升高了79%。與對照組相比，1、10、100 mg·L－1劑量SEP給藥組PPAR-α mRNA/β-actin吸光度比值分別降低了21%、43%和62%(P＜0.01)，表明隨著給藥劑量的升高，PPAR-α mRNA表達量逐漸降低(Fig 2)。

Fig 2 Effect of SEP on expression PPAR-α mRNA of hypertrophic heart cells of neonatal rats induced withhigh glucose and high insulin

3　討論

既往研究表明，高糖高胰島素直接參與了誘發(fā)心肌細胞肥大的形成過程［11］。因此，本實驗采用25.5 mmol·L－1葡萄糖與0.1 μmol·L－1的胰島素體外模擬高糖高胰島素血癥環(huán)境，來觀察海膽黃多糖SEP是否對高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的影響。結(jié)果表明，海膽黃多糖SEP能劑量依賴性減少肥大心肌細胞蛋白含量、細胞表面積和ANF mRNA的表達。同時，我們選擇了黃芪多糖作為陽性對照組，與海膽黃多糖SEP相比，黃芪多糖對肥大心肌細胞的抑制作用更為明顯，但海膽黃多糖SEP在體外糖尿病心肌細胞肥大模型中也展現(xiàn)了一定的抑制細胞肥大作用，這一結(jié)果提示我們SEP有潛力成為一種糖尿病心肌肥大治療的輔助藥物。

PPAR-α是一種主要分布在心臟、肝臟、腎臟等重要器官的核轉(zhuǎn)錄因子，對細胞生長、分化、心血管氧化應(yīng)激等過程具有一定的調(diào)控作用［12］，有研究表明其可通過抑制NF-κB而減輕心肌肥厚［13］。然而海膽黃多糖SEP是否也通過影響PPAR-α信號通路來產(chǎn)生抑制心肌細胞肥大的作用?目前仍尚不明確。為進一步探索SEP影響高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的作用機制，我們同時在實驗中檢測了不同劑量組SEP給藥情況下PPAR-α mRNA的表達水平變化，結(jié)果表明，SEP給藥后可一定程度上改善了心肌細胞肥大情況，同時PPAR-αmRNA的表達水平也隨著SEP給藥劑量逐漸減少，這表明PPAR-α信號通路很可能參與了高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的發(fā)生。

總之，本實驗首次在細胞水平上證明了海膽黃多糖SEP對高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的抑制作用，并初步探討了SEP抑制心肌細胞肥大的作用機制可能與PPAR-α有關(guān)。但除PPAR-α信號途徑外，是否仍有其它信號通路直接參與或與PPAR-α信號通路交互作用影響心肌細胞肥大過程?仍有待于我們進一步的研究。后續(xù)的實驗將采用基因表達豐度分析和Western blot技術(shù)等手段對SEP對肥大心肌細胞抑制作用的具體機制進行深入探索。

(致謝:本研究由商丘師范學(xué)院生物技術(shù)制藥實驗室完成，部分研究工作得到山東大學(xué)劉純慧教授和遼寧醫(yī)學(xué)院王洪新教授的指導(dǎo)，特表示感謝! )

參考文獻:

［1］Huynh K，Bernardo B C，McMullen J R，Ritchie R H.Diabetic cardiomyopathy: mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidant signaling pathways［J］.Pharmacol Ther，2014，142 (3) : 375－415.

［2］王冬，王政乾，田紅偉，等.海膽的研究進展及其應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中國海洋藥物雜志，2006，25(4) : 52－4.

［2］Wang D，Wang Z Q，Tian H W，et al.Research progress and current application of sea Urchin［J］.Chin J Mar Drugs，2006，25 (4) : 52－4.

［3］劉純慧，奚濤，林親雄，等.海膽黃多糖的分離、純化及免疫活性測定［J］.中國海洋藥物雜志，2006，25 (3) : 7－11.

［3］Liu C H，Xi T，Lin Q X，et al.Extraction，purification and immunological activity assay of a polysaccharide from eggs of sea urchin Strongylocentrotus nudus［J］.Chin J Mar Drugs，2006，25(3) : 7－11.

［4］Dai H，Jia G，Liu X，et al.Astragalus polysaccharide inhibits isoprenaline induced cardiac hypertrophy via suppressing Ca2+－mediated calcineurin/NFATc3 and CaMKII signaling cascades［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2014，38(1) : 263－71.

［5］張東蓮，王洪新，梁靈君，張晶.人參多糖對腹主動脈縮窄大鼠心肌肥厚及心肌能量代謝的影響［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30 (6) : 571－5.

［5］Zhang D L，Wang H X，Liang L J，Zhang J.Inhibitory effect of Ginseng polysaccharide on energy metabolism of myocardia hypertrophy induced by abdominal aorta constriction in rats［J］.Chin JMAP，2013，30 (6) : 571－5.

［6］周慶峰，王洪新，王桂君，楊育紅.高糖對高濃度胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的促進作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2003，19 (9) :1054－7.

［6］Zhou Q F，Wang H X，Wang G J，Yang Y H.Effect of high glucose and high insulin on NE-induced cardiac hypertrophy of the cultured myocardial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19 (9) :1054－7.

［7］Wang M，Wang J，Tan R，et al.Effect of Berberine on PPARα/NO activation in high glucose and insulin-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013: 285489.

［8］劉純慧，葉亮，林親雄，奚濤.海膽黃多糖SEP的制備及其抗腫瘤作用研究［J］.藥物生物技術(shù)，2006，13 (6) : 429－32.

［8］Liu C H，Ye L，Lin Q X，Xi T.Studies on preparation and antitumor activity of the polysaccharide from the eggs of Strongylocentrotus Nudus (SEP)［J］.Curr Pharm Biotechnol，2006，13 (6) : 429－32.

［9］梁春光，黃雷，戴紅良，劉濤.尿皮質(zhì)素誘導(dǎo)心肌細胞內(nèi)鈣離子升高與蘭尼堿受體活化的關(guān)系研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29(10) :1401－3.

［9］Liang C G，Huang L，Dai H L，Liu T.Relationship between urocortin enhanced［Ca2+］i of neonatal rat cardiomyocytes and ryanodine receptor activation［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29 (10) :1401－3.

［10］呂昕瞳，楊丹莉，鄧江，黃燮南.人參總皂苷對血管緊張素Ⅱ所致乳大鼠心肌細胞肥大的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27 (4) : 641－5.

［10］Lyu X T，Yang D L，Deng J，Huang X N.Inhibitory effect of total ginsenosides on cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensin Ⅱin neonatal rats［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2013，27 (4) : 641－5.

［11］周慶峰，王洪新，王怡薇，等.吡格列酮對高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20 (7) : 818－21.

［11］Zhou Q F，Wang H X，Wang Y W，et al.Effects of pioglitazone on hypertrophic myocardial cell ls induced with high glucose and high insulin［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20 (7) : 818－21.

［12］Le K，Li R，Xu S，et al.PPARα activation inhibits endothelin-1 induced cardiomyocyte hypertrophy by prevention of NFATc4 binding to GATA-4［J］.Arch Biochem Biophys，2012，518 (1) : 71－8.

［13］Meng R，Pei Z，Zhang A，et al.AMPK activation enhances PPARα activity to inhibit cardiac hypertrophy via ERK1/2 MAPK signaling pathway［J］.Arch Biochem Biophys，2011，511 (1－2) : 1－7.

Polysaccharide from eggs of S.nudus (SEP) prevents cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and high insulin in vitro in neonatal rat

ZHOU Qing-feng1，LIU Chun-hui2，WANG Hong-xin3
(1.Key Laboratory of Biotechnology Drug，Shangqiu Normal College，Shangqiu Henan 476000，China; 2.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250100，China; 3.Dept of Pharmacology，Liaoning Medical College，Jinzhou Liaoning 121001，China)

Abstract:AimTo study the protective effects of SEP on the hypertrophic myocardial cells induced with high glucose and high insulin and the mechanism.Methods

The protein content was assayed with Lowrys method; the cardiomyocytes area was measured by computer photograph analysis system; the expression of ANF and PPAR-α was determined by RT-PCR; APS was selected as control drug.ResultsCompared with conctrol group，the protein content，cardiomyocytes area and the expression of ANF and PPAR-α of high glucose and high insulin group were significantly increased.Compared with conctrol group，the SEP of different dosages were able to decrease the protein content，area，the expression of ANF mRNA and PPAR-α mRNA of cultured hypertrophic myocadial cells induced with high glucose and high insulin.ConclusionSEP can prevent cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and high insulin，which is related to its inhibition on PPAR-α signaling path.

Key words:myocardial cell; hypertrophy; neonatal rat; high glucose and high insulin; polysaccharide; SEP

作者簡介:周慶峰(1977－)，男，博士，副教授，研究方向:糖尿病生化藥物，E-mail: zhouqingfeng715@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No 30901877) ;河南省教育廳重點科技攻關(guān)項目(No 13B310196)

收稿日期:2015－01－07，修回日期:2015－03－30

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0844－04中國圖書分類號: R-332; R282.74; R322.11; R542.2; R587.2

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.021