吳浩等

摘 要 建立了一種利用氣相色譜燃燒同位素質(zhì)譜（Gas chromatographycombustionIsotope ratio mass spectrometers， GCCIRMS）測(cè)定葡萄酒中5種揮發(fā)性組分（即乙醇、丙三醇、乙酸、乳酸乙酯、2甲基丁醇）碳穩(wěn)定同位素比值新方法。優(yōu)化了GCCIRMS測(cè)定條件，進(jìn)樣量小于0.5 μL，樣品分析時(shí)間小于14 min。對(duì)以上5種揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定精密度為0.08‰～0.25‰，葡萄酒樣品的測(cè)定精密度為0.09‰～0.36‰，與元素分析同位素比率質(zhì)譜儀（Element analyzerisotope ratio mass spectrometers， EAIRMS）比較，其測(cè)定偏差低于0.5‰。利用該技術(shù)分析了產(chǎn)自法國(guó)、澳大利亞、美國(guó)和中國(guó)共54支葡萄酒中5種揮發(fā)性組分的碳穩(wěn)定同位素值并進(jìn)行產(chǎn)地溯源分析，判別分析（Discriminant analysis， DA）結(jié)果表明， 僅利用以上5種揮發(fā)性組分的碳同位素比值就能有效區(qū)分以上4個(gè)產(chǎn)地的葡萄酒，說(shuō)明葡萄酒揮發(fā)性成分穩(wěn)定碳同位素可應(yīng)用于葡萄酒的產(chǎn)地溯源。

關(guān)鍵詞 產(chǎn)地溯源； 同位素； 香氣成分； 葡萄酒； 氣相色譜燃燒同位素比率質(zhì)譜儀

1 引 言

近些年來(lái)，隨著中國(guó)葡萄酒市場(chǎng)的逐步擴(kuò)大，葡萄酒真?zhèn)蔚蔫b別越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界和監(jiān)測(cè)部門(mén)的重視[1]。歐洲作為葡萄酒主要生產(chǎn)國(guó)，對(duì)葡萄酒的產(chǎn)地、葡萄品種等一系列信息做了相關(guān)規(guī)定。針對(duì)葡萄酒的制假問(wèn)題，歐盟開(kāi)發(fā)了葡萄酒數(shù)據(jù)庫(kù)銀行（Wine DBbank）， 用于葡萄酒的真實(shí)屬性進(jìn)行鑒定[2]，但我國(guó)在葡萄酒鑒定方面的研究還非常的薄弱。

葡萄酒產(chǎn)地是評(píng)判其品質(zhì)的重要指標(biāo)，但目前還沒(méi)有有效方法能對(duì)葡萄酒產(chǎn)地進(jìn)行鑒別與溯源。過(guò)去幾十年里，國(guó)際上已經(jīng)發(fā)展了很多可用于葡萄酒產(chǎn)地溯源的方法，例如礦質(zhì)元素指紋法[3～5]、香氣指紋法[6～8]，以及穩(wěn)定同位素比值法[9～11]等，其中穩(wěn)定同位素比值能很好地指示地域和氣候特性，目前已經(jīng)成為產(chǎn)地溯源的重要方法。歐盟早在1992年就開(kāi)發(fā)了元素分析穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（Element analyzerisotope ratio mass spectrometers，EAIRMS）法測(cè)定葡萄酒中乙醇的δ13C值[2]，用于區(qū)分不同產(chǎn)地的葡萄酒，并將該方法作為測(cè)定葡萄酒乙醇的標(biāo)準(zhǔn)方法。但該方法需要利用復(fù)雜的蒸餾技術(shù)將葡萄酒中的乙醇蒸餾出來(lái)再測(cè)定，并且蒸餾過(guò)程中必須避免產(chǎn)生同位素分餾。復(fù)雜的前處理過(guò)程限制了該方法的廣泛應(yīng)用。目前，已有液相色譜穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（Liquid chromatography isotope ratio mass spectrometers， LCIRMS）測(cè)定葡萄酒中的乙醇、丙三醇的方法，但由于液相色譜法必須用水作為載流，因此大大降低了有機(jī)組分的分離效率，目前僅能分離乙醇和丙三醇[12]。利用氣相色譜燃燒穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜法（Gas chromatographycombustionisotope ratio mass spectrometers， GCCIRMS）不僅省去了復(fù)雜的前處理過(guò)程，也不會(huì)引入外來(lái)雜質(zhì)，保證可揮發(fā)性組分的測(cè)定速度和準(zhǔn)確性，并且能對(duì)葡萄酒中微量揮發(fā)性組分碳同位素比值進(jìn)行測(cè)定。不同產(chǎn)地葡萄酒可能由于其獨(dú)特的釀造方式和葡萄品種的差異極可能導(dǎo)致微量揮發(fā)性成分穩(wěn)定同位素組成的變化，因此香氣成分的穩(wěn)定同位素比值可作為產(chǎn)地溯源的指標(biāo)。另外，有些產(chǎn)區(qū)之間葡萄酒由于其地理氣候條件極其相似，傳統(tǒng)的礦質(zhì)元素和氫氧穩(wěn)定同位素難以進(jìn)行產(chǎn)地的區(qū)分。因此，多種揮發(fā)性成分的碳同位素指紋圖譜有可能成為一個(gè)新的葡萄酒產(chǎn)地溯源的指標(biāo)。本研究采用GCCIRMS測(cè)定葡萄酒中多種揮發(fā)性組分，即乙醇（Ethanol）、丙三醇（Glycerol）、乳酸乙酯（Ethyl lactate）、2甲基丁醇（2Methyl butanol）、乙酸（Acetic acid）的碳穩(wěn)定同位素比值方法，并探討此方法在葡萄酒產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

GCCIRMS： DELTA V Advantage同位素質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司），配備Trace GC氣相色譜儀與GCIsolink接口。EAIRMS：與GCCIRMS共用主機(jī)，配備 FlashEA1112元素分析儀。超純水由Millpore公司制造的MilliQ系統(tǒng)制備。He氣（高純99.999%，載氣）、CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)猓ˋir Products，USA）。HPINNOwax氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷倫（美國(guó)）公司）。

乙醇同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為BCR656 （歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），δ13CVPDB= 26.91‰±0.07‰，純度96%；乳酸乙酯（純度99.5%，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；2甲基丁醇（純度98%，美國(guó)Sigma公司）；乙酸、丙三醇（純度大于98%，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。除乙醇外，其它揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)品均沒(méi)有相應(yīng)的同位素標(biāo)準(zhǔn)值。因此，本研究以BCR656作為穩(wěn)定同位素值的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 樣品準(zhǔn)備

標(biāo)準(zhǔn)品配制：所有標(biāo)準(zhǔn)品均用超純水稀釋10倍，待測(cè)。

葡萄酒樣品來(lái)自出入境檢驗(yàn)檢疫送檢樣品和指定經(jīng)銷(xiāo)商采集。所選葡萄酒包括法國(guó)（10支）、美國(guó)（13支）、澳大利亞（19支）以及中國(guó)（12支）4個(gè)產(chǎn)地共54個(gè)樣品。為了突出產(chǎn)地區(qū)別，進(jìn)口葡萄酒品種（赤霞珠、西拉等）、年份（2008～2012）、生產(chǎn)廠商均隨機(jī)選擇。國(guó)產(chǎn)葡萄酒選取市場(chǎng)上常見(jiàn)的長(zhǎng)城、張?jiān)?、香格里拉以及王朝等品牌葡萄酒，代表了中?guó)主要葡萄酒產(chǎn)地，主要葡萄品種為赤霞珠。葡萄酒開(kāi)瓶后搖勻，一次性注射器（5 mL）吸取葡萄酒樣，用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾至1.5 mL樣品瓶中，待測(cè)。

2.3 儀器條件

由于不同組分揮發(fā)性成分在葡萄酒中的含量差異較大，因此為了達(dá)到較好的分離效率和準(zhǔn)確度，本方法擬采用不同的分離條件進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1 GC條件 乙醇：進(jìn)樣量0.1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純He，流速1.5 mL/min，分流比200∶1。程序升溫條件：初溫40 ℃，保留1 min，50 ℃/min升溫至220 ℃，保留3 min。

丙三醇：進(jìn)樣量0.2 μL，進(jìn)樣口溫度270 ℃，載氣為高純He，流速1.5 mL/min，分流比20∶1。程序升溫條件：初溫80 ℃，保留1 min，15 ℃/min升溫至240 ℃，保留2 min。

其它組分： 進(jìn)樣量0.5 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣高純He，流速1.5 mL/min，分流比10∶1。程序升溫條件：初溫80 ℃，保留1 min，15 ℃/min升溫至240 ℃，保留6 min。

2.3.2 GC Isolink條件 燃燒管溫度1000 ℃，切入質(zhì)譜時(shí)間200 s。

2.3.3 EA條件 氧化爐960 ℃，柱溫60 ℃，O2流速200 mL/min，充氧時(shí)間3 s，載氣流速200 mL/min。

2.3.4 質(zhì)譜條件

離子源電壓2.97 kV，真空度1.6×10 6 Pa； 轟擊電壓120.8 eV。

2.4 精度和準(zhǔn)確性測(cè)定

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，取10次測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard deviation， SD）作為GCCIRMS的測(cè)定精度。除乙醇外，其它揮發(fā)性組分標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有相應(yīng)的同位素標(biāo)準(zhǔn)值，因此本研究以EAIRMS測(cè)定值作為參考，確定GCCIRMS方法測(cè)定準(zhǔn)確性范圍。隨機(jī)選取3支葡萄酒，分別測(cè)定上述5種揮發(fā)性成分，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法測(cè)定實(shí)際樣品的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

Thermo electron isodat version 3.0軟件用于同位素值的計(jì)算和數(shù)據(jù)獲取。方差分析（Oneway ANOVA）和判別分析（Discrimination analysis，DA）采用SPSS19.0（美國(guó)，IBM）進(jìn)行分析。繪圖軟件采用Origin 8.5（美國(guó)Originlab公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)圖繪制。

3 結(jié)果與討論

3.1 測(cè)定條件優(yōu)化

穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀具有極高的靈敏度，極易受到外界條件和儀器本身狀態(tài)的影響，因此確保儀器的穩(wěn)定是進(jìn)行樣品分析的前提。實(shí)驗(yàn)室保持26 ℃左右恒溫，溫度變化不超過(guò)1 ℃/h，濕度60%左右，并提前對(duì)色譜柱進(jìn)行必要的老化，燃燒管加熱到指定溫度后至少穩(wěn)定4 h。運(yùn)行參考?xì)鉁y(cè)試，直至10組參考?xì)庵档臉?biāo)準(zhǔn)差小于0.06‰才能進(jìn)行樣品測(cè)試。

由于IRMS測(cè)定同位素值主要是樣品與參考CO2氣體的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行比較，因此測(cè)定值受到樣品與參考?xì)庑盘?hào)強(qiáng)度比值的影響。為了評(píng)估樣品濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，將乙醇標(biāo)準(zhǔn)（BCR 656）按2%， 4%， 6%， 8%， 10%， 12%， 20%， 30%和50%進(jìn)行稀釋?zhuān){(diào)節(jié)分流比和進(jìn)樣量， 形成500～25000 mV信號(hào)強(qiáng)度梯度，并測(cè)定該標(biāo)準(zhǔn)溶液的δ13C值，重復(fù)測(cè)定5次。如圖1所示，當(dāng)參考?xì)庑盘?hào)設(shè)置為3000 mV，樣品信號(hào)強(qiáng)度處于3000～10000 mV附近時(shí)能得到穩(wěn)定的同位素值。由于信號(hào)強(qiáng)度越大，氧化管的消耗也越大，綜合考慮分析的準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)性，設(shè)定樣品信號(hào)在3000～4000 mV之間最佳。

由于同位素質(zhì)譜儀靈敏度極高，純乙醇和丙三醇不能直接進(jìn)樣測(cè)定，需要進(jìn)行稀釋。本實(shí)驗(yàn)采用的HPInnowax色譜柱為耐水極性柱，對(duì)醇類(lèi)和酯類(lèi)等極性成分具有良好的分離效果，能夠承受較高的水分，因此揮發(fā)性成分的標(biāo)準(zhǔn)品均采用超純水稀釋。所選擇的5種揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)品在相應(yīng)測(cè)定條件下將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍后測(cè)定其δ13C值，根據(jù)國(guó)際通行的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[13，14]，測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）應(yīng)小于0.3‰。如表1所示，EAIRMS和GCCIRMS精度均能達(dá)到要求。由于EA測(cè)定碳同位素時(shí)需要進(jìn)行包樣操作，揮發(fā)性成分在包樣過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致碳的同位素分餾，而且不同標(biāo)準(zhǔn)品（非同位素標(biāo)準(zhǔn)品）的純度和雜質(zhì)含量也會(huì)導(dǎo)致EAIRMS與GCCIRMS的測(cè)定值存在差異，但差異均小于0.5‰。

3.3 穩(wěn)定性

葡萄酒基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，一些微量未知組分可能干擾色譜分離，進(jìn)而影響測(cè)定精度。因此，為了測(cè)試本方法對(duì)實(shí)際樣品分析的穩(wěn)定性，取任意3只葡萄酒分別進(jìn)行5次重復(fù)分析，計(jì)算其SD值。結(jié)果表明（見(jiàn)表2），乙醇、乙酸和2甲基丁醇的SD值優(yōu)于0.2‰，在儀器分析誤差（0.3‰）范圍內(nèi)；乳酸乙酯、丙三醇的SD值優(yōu)于0.4‰，小于GCCIRMS

[TS（][HT5”SS] 圖4 不同國(guó)家葡萄酒中5中揮發(fā)性成分的δ13C值差異

Fig.4 Comparison of δ13C values of five volatile components in wine among different countries[HT5][TS）]

對(duì)葡萄酒樣品的分析誤差0.6‰[15]，因此， 本方法對(duì)葡萄酒揮發(fā)性組分的碳同位素分析滿足穩(wěn)定性要求。

3.4 產(chǎn)地溯源分析

為了檢測(cè)揮發(fā)性組分碳穩(wěn)定同位素比值分析在葡萄酒產(chǎn)地溯源中的有效性，選取了產(chǎn)自澳大利亞（Australia）、美國(guó)（USA）、法國(guó)（France）和中國(guó)（China）葡萄酒，利用本方法分別測(cè)定葡萄酒中5種主要的揮發(fā)性組分的碳同位素值。Oneway ANOVA分析結(jié)果表明，不同國(guó)家葡萄酒的不同揮發(fā)性成分碳同位素存在差異（圖4），說(shuō)明葡萄酒的揮發(fā)性碳同位素成分具有產(chǎn)地差別，能用于產(chǎn)地溯源分析。

葡萄酒中的揮發(fā)性組分均來(lái)自于葡萄果醬和糖酵解過(guò)程[16]。不同產(chǎn)地的釀酒葡萄由于種類(lèi)和生長(zhǎng)環(huán)境的不同引起葡萄酒中有機(jī)組分的碳同位素差異[17]。以往的研究均關(guān)注于葡萄酒中的乙醇和丙三醇的碳同位素的分析[11，14，17]，主要由于乙醇和丙三醇為主要的糖酵解產(chǎn)物，能代表產(chǎn)地葡萄的碳同位素。然而，由于不同產(chǎn)地的釀造風(fēng)格差異可能引起其它微量揮發(fā)性組分的差異，因此理論上可以利用多種揮發(fā)性組分的碳同位素指紋對(duì)葡萄酒的產(chǎn)地進(jìn)行溯源。美國(guó)、澳大利亞和中國(guó)同屬于新世界葡萄酒產(chǎn)區(qū)，其葡萄酒釀造方法與法國(guó)等歐洲舊世界葡萄酒產(chǎn)區(qū)具有較大差別，為了迎合消費(fèi)者口味，新世界葡萄酒釀造方法也形成了獨(dú)特的風(fēng)格[18]。利用5種揮發(fā)性組分的碳同位素比值結(jié)合判別分析對(duì)4個(gè)國(guó)家的葡萄酒進(jìn)行分類(lèi)（圖5）。結(jié)果表明，各國(guó)葡萄酒能明顯分開(kāi)，說(shuō)明葡萄酒揮發(fā)性成分同位素能用于葡萄酒的產(chǎn)地溯源分析。

4 結(jié) 論

GCCIRMS能快速測(cè)定葡萄酒中揮發(fā)性組分的碳穩(wěn)定同位素比值，測(cè)試結(jié)果可靠，準(zhǔn)確率和精度均滿足測(cè)定需求。對(duì)法國(guó)、美國(guó)、澳大利亞和中國(guó)4個(gè)國(guó)家葡萄酒的判別分析表明，本方法能對(duì)4個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒進(jìn)行有效區(qū)分，預(yù)期將能應(yīng)用于葡萄酒造假行為鑒別。

References

1 GAO PeiJun， CHENG JinSong， WANG ChengMing. SinoOverseas Grapevine & Wine， 2012， （5）： 58-62

高培鈞， 程勁松， 王承明. 中外葡萄與葡萄酒， 2012， （5）： 58-62

2 Communities the Commission of the European. Determining Community Methods for the Analysis of Wines. Commission Regulation （EEC） No 2676/90 of 17 September 1990

3 lvarez M， Moreno I M， Jos ， Camen A M， Gustavo Gonzlez A. Microchem. J.， 2007， 87（1）： 72-76

4 Rodrigues S M， Otero M， Alves A A， Coimbra J， Coimbra M A， Pereira E， Duarte A C. J. Food. Compos. Anal.， 2011， 24（4）： 548-562

5 LUO Mei， LIU GuoJie， LI DeMei， HUANG WeiDong， ZHAN JiCheng. Chinese J. Anal. Lab.， 2009， 28（12）： 35-38

羅 梅， 劉國(guó)杰， 李德美， 黃衛(wèi)東， 戰(zhàn)吉宬. 分析試驗(yàn)室， 2009， 28（12）： 35-38

6 Pillonel L， Ampuero S， Tabacchi R， Bosset J. Eur. Food. Res. Technol.， 2003， 216（2）： 179-183

7 MA Lei， TANG Ke， HAN YeHui， LI JiMing， XU Yan. Sci. Technol. Food Industry， 2012， 33（19）： 128-13

馬 磊， 唐 柯， 韓業(yè)慧， 李記明， 徐 巖. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（19）： 128-133

8 QIN LiNa， NI YuanYing， LIANG FangHua， WANG Fang， LI JingMing. Liquormaking Science & Technology， 2008， 164（2）： 40-44

秦麗娜， 倪元穎， 梁方華， 王 方， 李景明. 釀酒科技， 2008， 164（2）： 40-44

9 Franke B M， Koslitz S， Micaux F， Piantini U， Maury V， Pfammatter E， Wunderli S， Gremaud G， Bosset J O， Hadorn R. Eur. Food. Res. Technol.， 2008， 226（4）： 761-769

10 Fronza G， Fuganti C， Grasselli P， Reiero F， Guillou C， Breas O， Sada E， Rossmann A， Hermann A. J. Agr. Food Chem.， 1998， 46（2）： 477-480

11 GimenezMiralles J E， Salazar D M， Solana I. J. Agr. Food Chem.， 1999， 47（7）： 2645-2652

12 Krummen M， Hilkert A W， Juchelka D， Duhr A， Schluter H J， Pesch R. Rapid Commun. Mass Spectro.， 2004， 18（19）： 2260-2266

13 Detemination by Isotope Ratio Mass Spectometry13C/12C of Wine Enthanol or that Obtained Through the Fermentation of Musts， Concentrated Musts or Grape Sugar. International Office of Vine and Wine. Resolution Oeno 17/2001

14 Cabaero A I， Recio J L， Rupérez M. Rapid Commun. Mass Spectro.， 2008， 22（20）： 3111-3118

15 International Organization of Vine and Wine （OIV）. Resolution OENO 3432010

16 WANG ShuSheng， LI WangYuan. Wine Chemistry. Beijing： Science Press， 2005： 26-27

王樹(shù)聲， 李王袁. 葡萄酒化學(xué). 北京： 科學(xué)出版社， 2005： 26-27

17 Guyon F， Gaillard L， Salagoity M H， Medina B. Anal. Bioanal. Chem.， 2011， 401（5）： 1551-1558

18 Johnson H， Robinson J. The World Atlas of Wine. London： Mitchell Beazley 2007： 15

Abstract A method was developed for analyzing the stable carbon isotope ratio of five volatile components （Ethanol， Glycerol， Acetic acid， Ethyl lactate， 2methylbutanol） in wine using gas chromatographycombustionisotope ratio mass spectrometer （GCCIRMS）. The sample injection volume was less than 0.5 μL， and the analytical time of each run was less than 14 min. The precision of this method was 0.08‰-0.25‰ for analyzing standards， while 0.09‰-0.36‰ for wine samples. Compared to element analysisisotope ratio mass spectrometry （EAIRMS） results， the deviations were lower than 0.5‰. Fiftyfour wine samples from France， Australia， America and China were considered. The δ13C of five volatile components were measured using GCCIRMS. Discriminant analysis （DA） was employed for analyzing the geographical origin traceability of selected wine. The result indicated that δ13C of volatile components could be used to distinguish the origin of wines. The method was shown to be effective in improving detection of the origin traceability of wine.

Keywords Geographical origin traceability； Isotope； Volatile component； Wine； Gas chromatography combustionisotope ratio mass spectrometry

（Received 30 August 2014； accepted 13 December 2014）