段宏等

摘 要 以羧基化CdTe/ZnSe量子點(diǎn)熒光微球?yàn)闊晒鈽?biāo)記物，采用1乙基（3二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）法偶聯(lián)抗惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白（Pf）單克隆抗體制備熒光探針；以羊抗惡性瘧原蟲組氨酸多克隆抗體和驢抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維膜，形成試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線，建立了免疫層析試紙條定量檢測(cè)血清中惡性瘧原蟲的方法。所使用的羧基化量子點(diǎn)熒光微球的熒光強(qiáng)度為單個(gè)量子點(diǎn)的2800倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該熒光試紙條定量檢測(cè)血清中惡性瘧原蟲線性范圍為5.8～8010 Parasite/μL，最低靈敏度達(dá)到5.8 Parasite/μL， 單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間只需15 min。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)顯示，試紙條批內(nèi)回收率為93.0%～111.8%，批間回收率為98.3%～115.1%，且批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。

關(guān)鍵詞 量子點(diǎn)熒光微球； 免疫層析試紙條； 惡性瘧原蟲； 定量檢測(cè)

1 引 言

瘧疾（Malaria）是一種由瘧原蟲引起的紅細(xì)胞內(nèi)寄生蟲病，其中90%由惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）侵染造成[1，2]。該病由攜帶瘧原蟲的按蚊通過叮咬方式進(jìn)行傳播，是目前在全球范圍內(nèi)造成死亡人數(shù)最多的一種寄生蟲病。瘧疾常見的診斷方法包括以鏡檢法為基礎(chǔ)的病原學(xué)診斷、以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)診斷以及以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為代表的分子生物學(xué)診斷方法。傳統(tǒng)的鏡檢方法是瘧疾診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，對(duì)操作人員的專業(yè)技能要求較高，且平均靈敏度只有50～100 Parasite/μL，因此不能適應(yīng)當(dāng)前瘧疾快速診斷的臨床需求[3，4]。PCR方法檢測(cè)靈敏度較高，且可以確定瘧原蟲的種屬，對(duì)瘧疾的有效防治具有較大的指導(dǎo)作用；但該方法檢測(cè)瘧原蟲需要特殊的設(shè)備及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的支持，對(duì)操作人員實(shí)驗(yàn)技能要求較高，不適合基層醫(yī)院及現(xiàn)場(chǎng)的即時(shí)檢驗(yàn)（Pointofcare testing， POCT）[5，6]。

以膠體金為標(biāo)記物的免疫層析方法，因具有快速、使用簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[7]，已逐漸應(yīng)用于瘧疾的現(xiàn)場(chǎng)診斷，目前約有30余種膠體金免疫層析試紙條商品。但常規(guī)膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)瘧原蟲靈敏度普遍偏低，只有50～100 Parasite/μL [8]，且易受血樣基質(zhì)及外界條件的干擾而出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。因此，在一定程度上限制了其推廣使用。新型熒光標(biāo)記物（如熒光微球等）能有效消除有色樣品本底的基質(zhì)干擾， 提高檢測(cè)靈敏度，是目前免疫層析方法定量檢測(cè)的首選標(biāo)記物之一[9]。李懷明等[10]曾采用Ru（4，7Ph2phen）3 染料摻雜的熒光硅球?yàn)樘结槪?建立了豬尿中鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙條定量檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于膠體金免疫層析試紙條定性檢測(cè)方法。量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）作為一種新型的熒光標(biāo)記材料，具有激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬、斯托克位移大、熒光譜峰狹窄對(duì)稱及耐光漂白等優(yōu)良的光學(xué)特質(zhì)[11]，已廣泛應(yīng)用于提高免疫層析方法的檢測(cè)靈敏度。如Beloglazova等[12]將QDs作為免疫探針用于免疫層析試紙條法檢測(cè)玉米赤霉烯酮，靈敏度為0.03 ng/mL。崔希等[13]將免疫磁分離結(jié)合膠體金免疫層析方法快速測(cè)定大腸桿菌。量子點(diǎn)微球（Quantumdot submicrobeads，QBs）通過將大量的量子點(diǎn)包裹于聚合物微球中，使得熒光強(qiáng)度進(jìn)一步提高，由于包有聚合物的外層，亦進(jìn)一步增強(qiáng)了QBs光學(xué)及溶液穩(wěn)定性[14]。Zhang等[15]以QBs為探針，建立了基于膜片的乙肝表面抗原斑點(diǎn)雜交免疫學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)限達(dá)到0.078 ng/mL。本實(shí)驗(yàn)室以QBs為探針，建立了免疫層析試紙條檢測(cè)食品中黃曲霉毒素B1的方法，靈敏度高達(dá)0.42 pg/mL[16]。本研究以Pf中富組氨酸蛋白（HRPⅡ）為檢測(cè)抗原，以CdTe/ZnSe QBs標(biāo)記抗HRPⅡ單克隆抗體，建立了基于QBs為探針的免疫層析試紙條超靈敏快速定量檢測(cè)血清中Pf的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

XY Z3000點(diǎn)膜儀（BioDot公司）；自動(dòng)切條儀（金標(biāo)生物科技公司）；粒徑分析儀（英國(guó)馬爾文公司）；JEOL JEM 2100高分辨率透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；便攜式熒光試紙條讀取儀（上?；娇茖W(xué)儀器有限公司）；硝酸纖維膜（ NC 膜） 、結(jié)合墊、吸水紙及PVC底板（美國(guó)Millipore公司）。

表面羧基修飾的CdTe/ZnSe量子點(diǎn)聚合物微球（QBs，美國(guó)Ocean Nnotech.公司贈(zèng)送）；滅活的Pf陽(yáng)性血清（美國(guó)夏威夷大學(xué)George Hui教授提供， 濃度為2.4×105 Parasite/μL）；鼠抗HRPⅡ單克隆抗體（Mouse antiHRPⅡ mAb）與羊抗Pf多克隆抗體（Goat antiHRPⅡ pAb）由北京金源佳和生物科技有限公司免費(fèi)提供；驢抗鼠二抗（北京中山生物科技公司）；人血清（索萊寶公司）；牛血清白蛋白（BSA）、乙基（3二甲基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，sigma公司）；其它試劑均為分析純。

2.2 QBs標(biāo)記探針的制備

采用EDC一步法[17]將QBs上的羧基與鼠抗HRPⅡ單克隆抗體上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)。具體步驟如下：將0.6 mg QBs、40 μg EDC與10 mL PB緩沖液（pH 6.0， 0.01 mol/L）混勻后，加入120 μg鼠抗HRPⅡ單克隆抗體；室溫?cái)嚢璺磻?yīng)45 min后繼續(xù)加入40 μg EDC以及1.2 mL 10% （w/V）BSA溶液進(jìn)行封閉反應(yīng)2 h；反應(yīng)溶液以13000 r/min 離心10 min，2 mL 超純水洗滌沉淀，離心，沉淀復(fù)溶于2 mL PBS（pH 7.4，0.01 mol/L，含2%果糖，1%聚乙二醇2000， 5%蔗糖，1% BSA，0.4%吐溫20）中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將不同濃度羊抗HRPⅡ多克隆抗體（0.5， 1.0和1.5 g/L）和驢抗鼠二抗（0.5 g/L）分別噴凃于NC膜上作為Pf檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），NC膜于37℃干燥12 h。將預(yù)處理好的NC膜、結(jié)合墊以及吸水紙依次粘貼在PVC 底板上，使用自動(dòng)切條機(jī)將其切成寬度為4 mm的試紙條，室溫干燥保存?zhèn)溆?。[TS（][HT5”SS] 圖1 免疫層析試紙條檢測(cè)原理（A為陽(yáng)性，B為陰性）

Fig.1 Schematic diagram of immunochromatographic strips

1. 結(jié)合墊（Conjugate pad）； 2. PVC底板（PVC plate）； 3. 硼酸纖維膜（Nitrocellulse membrane）； 4. 檢測(cè)線（Test line）； 5. 質(zhì)控線（Control line）； 6. 吸水紙（Absorbent pad）。A： Positive sample，B： Negative sample.[HT5][TS）]

血清中Pf檢測(cè)流程如圖1所示。將1.5 μL QBs探針與68.5 μL血清混合孵育5 min后，加到試紙條結(jié)合墊上，室溫反應(yīng)10 min后，熒光試紙條讀取儀讀取試紙條T、C線熒光強(qiáng)度。當(dāng)血清中含有Pf時(shí)，QBs探針上的鼠抗HRPⅡI單克隆抗體與HRPⅡ蛋白結(jié)合，免疫復(fù)合物經(jīng)NC膜遷移至試紙條T線區(qū)域與羊抗HRPⅡ多克隆抗體結(jié)合，形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物，T線出現(xiàn)熒光條帶，熒光強(qiáng)度與Pf濃度呈正相關(guān)（未出現(xiàn)Hook效應(yīng)之前）；反之，則QBs探針不能被T線上的羊抗HRPⅡ多克隆抗體捕獲，T線無(wú)熒光條帶，未被T線捕獲的QBs探針進(jìn)一步遷移至試紙條C線區(qū)域，與C線上的驢抗鼠二抗結(jié)合產(chǎn)生熒光。若C線不顯熒光條帶，檢測(cè)無(wú)效。

2.4 QBs試紙條制備及檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.4.1 QBs探針抗體標(biāo)記量?jī)?yōu)化 取50， 100， 150， 200， 250， 300， 350和400 μg鼠抗HRPⅡ單克隆抗體分別標(biāo)記1 mg QBs。獲得的QBs探針與Pf濃度為244 Parasite /μL（P/μL）血清孵育5 min后，加入試紙條，30 min后檢測(cè)（T線：羊抗HRPⅡ多克隆抗體噴涂液濃度為1.0 g/L，C線：驢抗鼠二抗噴涂液濃度為0.5 g/L），熒光讀取儀讀取T線熒光強(qiáng)度，以T線產(chǎn)生熒光信號(hào)最強(qiáng)為QBs 最佳抗體標(biāo)記量。

2.4.2 QBs試紙條的優(yōu)化

在最佳抗體標(biāo)記濃度下，通過棋盤滴定實(shí)驗(yàn)確定QBs探針以及T線上多抗最佳劑量。試紙條定量分析的最佳判讀時(shí)間采用免疫動(dòng)力學(xué)分析方法進(jìn)行確定。具體方案如下：在最優(yōu)條件下，將70 μL待測(cè)血清（含1.5 μL QBs探針，血清Pf濃度為244 Parasite/μL）加入試紙條加樣孔后，每隔1 min，熒光讀取儀記錄試紙條T、C線熒光強(qiáng)度（FT， FC）以及T、C線熒光強(qiáng)度比值（FT/FC）。繪制FT、FC以及FT/FC 隨反應(yīng)時(shí)間變化的曲線圖，以FT/FC達(dá)到穩(wěn)定值的時(shí)間為試紙條定量分析的最佳判讀時(shí)間。

2.4.3 血清Pf檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最適條件下，將滅活的Pf分別添加至Pf陰性的人血清中配制Pf濃度為0～3.2×105 Parasite/μL的不同樣品，QBs試紙條檢測(cè)，10 min后熒光讀取儀讀取試紙條FT/FC比值，每個(gè)濃度樣本重復(fù)檢測(cè)3次。以Pf濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)T/FC值為縱座標(biāo)，繪制檢測(cè)血清中Pf標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.4 QBs免疫層析試紙條性能初步評(píng)價(jià)

通過批內(nèi)以及批間加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)QBs熒光試紙條檢測(cè)血清中Pf的準(zhǔn)確性以及精密度，具體步驟如下：取陰性人血清，分別添加Pf至終濃度為 22.25， 360和4800 Parasite/μL。使用同一批次試紙條檢測(cè)以上加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算Pf加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以評(píng)價(jià)試紙條的批內(nèi)穩(wěn)定性；隨后每隔5天連續(xù)檢測(cè)3次，計(jì)算加標(biāo)樣品的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以評(píng)價(jià)試紙條的批間穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與討論

3.1 QBs表征

透射電鏡圖片顯示QBs聚合物微球呈球形，粒徑分布均勻（圖2A）；單個(gè)粒子的高分辨率電鏡結(jié)果顯示聚合物中包埋了大量的油溶性CdTe/ZnSe量子點(diǎn)（圖2A插圖）。激光動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果顯示裸露的QBs平均水化粒徑為255 nm，而QBs探針平均水化粒徑增加至295 nm，表明抗HRPⅡ單克隆抗體成功偶聯(lián)至QBs表面（圖2B）。QBs熒光光譜顯示其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm，且3.5 × 10 3 nmol/L QBs溶液熒光強(qiáng)度與10 nmol/L水溶性CdTe/ZnSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度基本相同，即QBs熒光強(qiáng)度較CdTe/ZnSe量子點(diǎn)增強(qiáng)了2800多倍（Con.QD/Con.QBs=（10 nmol/L）/（3.5 × 10 3 nmol/L） = 2857）。

3.2 QBs探針抗體標(biāo)記量?jī)?yōu)化

用不同抗體標(biāo)記量的QBs探針檢測(cè)Pf加標(biāo)血清（244 Parasite/μL），讀取儀記錄T線熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)抗體標(biāo)記量從50 μg/mg增加至200 μg/mg時(shí)，試紙條T線熒光強(qiáng)度由579增至1076；當(dāng)抗體標(biāo)記量介于200～250 μg/mg時(shí)，T線熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值；進(jìn)一步增加抗體標(biāo)記量，T線熒光強(qiáng)度反而降低。這是由于隨著QBs表面抗體標(biāo)記數(shù)量的增加，T線熒光強(qiáng)度增加，但是當(dāng)QBs表面抗體標(biāo)記濃度過高時(shí)，由于空間位阻效應(yīng)，QBs探針結(jié)合活性反而下降，且隨著抗體數(shù)量增多，活性下降越顯著，導(dǎo)致T線熒光強(qiáng)度的降低。因此，本研究以200 μg抗體標(biāo)記1 mg QBs為最佳抗體標(biāo)記濃度。

3.3 QBs試紙條的優(yōu)化

QBs探針用量及T線上羊抗HRPⅡ多克隆抗體噴涂濃度也是影響熒光試紙條靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)。本研究通過棋盤滴定實(shí)驗(yàn)優(yōu)化QBs探針及T線羊抗HRPⅡ多克隆抗體用量，結(jié)果見表1。從表1可知，當(dāng)T線羊抗Pf多克隆抗體濃度為1.5 g/L，QBs探針用量為1.5 μL時(shí)，試紙條T線熒光強(qiáng)度達(dá)到最高1281（血清Pf濃度為244 Parasite/μL）。考慮到靈敏度以及檢測(cè)成本，本實(shí)驗(yàn)采用T線羊抗Pf多克隆抗體濃度為1.5 g/L，QBs探針用量1.5 μL為最佳值。

試紙條熒光信號(hào)最佳判讀時(shí)間的確定是實(shí)現(xiàn)試紙條定量分析的前提。通過試紙條測(cè)定陽(yáng)性血清（244 Parasite/μL）的免疫動(dòng)力學(xué)曲線（圖4）可見，隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，試紙條T線和C線熒光強(qiáng)度迅速上升，且在30 min內(nèi)FT、FC值未達(dá)到穩(wěn)定值；而FT/FC比值在加樣后10 min后即趨于穩(wěn)定，且在隨后20 min內(nèi)比值無(wú)明顯變化。此結(jié)果表明，F(xiàn)T/FC比值為考察對(duì)象，可在一定范圍內(nèi)可有效消除免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異，縮短試紙條定量分析的結(jié)果判讀時(shí)間，這與本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于膠體金免疫層析定量分析方法研究的結(jié)論一致[18]。因此Pf熒光試紙條最佳定量分析時(shí)間確定為加樣后10 min。

3.4 QBs免疫層析試紙條定量檢測(cè)Pf的標(biāo)準(zhǔn)曲線

QBs免疫層析試紙條檢測(cè)血清中Pf的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5A。血清中Pf 濃度在5.8～8010 Parasite/μL時(shí)，F(xiàn)T/FC比值隨Pf濃度的增加而增大，其線性方程為y=0.0113x+0.016（R2=0.999）。當(dāng)血清中Pf 濃度低于5.8 Parasite/μL時(shí)，熒光讀取儀不能讀取試紙條T線熒光數(shù)據(jù)；進(jìn)一步將其置于紫外光下觀測(cè)，在T線區(qū)域也未見熒光條帶，檢測(cè)Pf陽(yáng)性和陰性的試紙條實(shí)物見圖5B。依據(jù)以上結(jié)果，設(shè)定QBs熒光試紙條檢測(cè)血清中Pf檢出限（靈敏度）為5.8 Parasite/μL。當(dāng)血清中Pf濃度大于8010 Parasite/μL時(shí)， FT/FC值出現(xiàn)隨著Pf濃度的增大而下降的現(xiàn)象。分析其原因可能是Pf濃度過高，使得大量游離的Pf與T線上抗HRPⅡ多抗結(jié)合，從而阻礙了T線多抗與PfQBs探針免疫復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致FT/FC值下降，即出現(xiàn)了類似于雙抗夾心免疫法中常見的Hook效應(yīng)。

3.5 QBs免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)

在陰性血清中添加高、中、低不同濃度的Pf，用QBs熒光試紙條檢測(cè)，以試紙條批間、批內(nèi)的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性與精密度，結(jié)果見表2。當(dāng)Pf加標(biāo)濃度為22.25，360和4800 Parasite/μL時(shí)，熒光試紙條批內(nèi)回收率分別為111.9%， 106.9%和93.0%； 批間回收率分別為115.1%， 105.1以及98.3%；且試紙條批間、批內(nèi)測(cè)定的RSD值均小于5%。以上結(jié)果表明，基于量子點(diǎn)微球的免疫層析試紙條方法檢測(cè)血清中Pf具有良好的回收率及準(zhǔn)確度，可對(duì)快速、靈敏地定量分析血清中Pf。

本研究以QBs為探針，成功建立了免疫層析法快速定量檢測(cè)人體血清中Pf的方法?；赒Bs的高熒光強(qiáng)度，Pf熒光試紙條檢出限達(dá)到5.8 P/μL，靈敏度較目前常規(guī)膠體金免疫層析試紙條方法提高約10倍。相比于實(shí)驗(yàn)室常用的PCR及金標(biāo)準(zhǔn)鏡檢方法，Pf熒光試紙條方法檢測(cè)只需15 min，且不需昂貴的設(shè)備、復(fù)雜的操作以及專業(yè)的操作人員，適于Pf的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

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Abstract A CdTe/ZnSe quantumdot submicrobead （QBs）， which exhibited fluorescence intensity approximately 2800fold stronger than that of single quantum dots， was conjugated with the antihistidine rich protein（HRP）Ⅱ mAbs using N（3（Dimethylamino）propyl）N′ethylcarbodiimide hydrochloride （EDC） method as fluorescence probe. The goat antiHRPⅡ polyclonal antibodies and donkey antimouse polyclonal antibodies were sprayed onto the nitrocellulose membrane as test line and control line， respectively. The resultant fluorescence probes were introduced to the immunochromatographic strip for the quantitative determination of Plasmodium falciparum. For determination of Plasmodium falciparum in serum， the QBs based immunochromatographic strips exhibited a good dynamic linear range from 5.8 Parasite/μL to 8010 Parasite/μL with a limit of detection of 5.8 Parasite/μL. The detection time of the proposed QBs based immunochromatographic strips for each sample was only 15 min. Moreover， the recovery rates of the intra and interassay ranged from 93.0% to 111.9%， and 98.3% to 115.1% respectively， while the relative standard deviations （RSDs） of intra and interassay were below 5%.

Keywords Quantumdot submicrobeads； Immunochromatographic strip； Plasmodium falciparum； Quantitative detection

（Received 19 September 2014； accepted 15 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.31160323） and the National Institute of Health of United State （No.1R43AI092962）