趙雪慧，何 德

（西南林業(yè)大學(xué) 生 命科學(xué)學(xué)院，云南 昆 明650224）

1 引言

在化石能源日益枯竭的今天，麻瘋樹（Jatrophacurcas）作為一種生物柴油樹種，生物質(zhì)能源的重要來源，因?yàn)槠涔麑?shí)的高含油量，越來越受到世界各國(guó)的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，麻瘋樹的果實(shí)含油量能高達(dá)40%［1］。雖然麻瘋樹種子含油率很高，但是其果實(shí)的產(chǎn)量問題卻是一大難題，究其原因，麻瘋樹是一種雌雄同株異花的植物，雌雄花位于同一個(gè)花序，但是同一個(gè)花序的雌花的數(shù)量卻要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于雄花，有研究者指出麻瘋樹同一花序上，麻瘋樹的雌雄花比例大致為1∶10～1∶20［2～4］，這直接限制了麻瘋樹的大批量種子繁殖，于是各國(guó)學(xué)者紛紛將目光投向了組織培養(yǎng)。作為當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域普遍使用的繁殖技術(shù)，組織培養(yǎng)有許多的優(yōu)點(diǎn)，能夠保存母本的優(yōu)良性狀。目前關(guān)于麻瘋樹的組織培養(yǎng)已有一定的成果，許多研究者分別使用不同的外植體、不同激素、不同環(huán)境對(duì)麻瘋樹的組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究，普遍使用的是MS基本培養(yǎng)基，輔以BA、TDZ、IBA、NAA等外源激素，以實(shí)現(xiàn)麻瘋樹組培苗的快繁［5～10］。目前尚未見到使用其他基本培養(yǎng)基對(duì)麻瘋樹進(jìn)行組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)是否能夠獲得成功，培養(yǎng)基的選擇是非常重要的一個(gè)環(huán)，不同的培養(yǎng)基具有不同的特點(diǎn)。MS培養(yǎng)基由于其無機(jī)鹽和離子濃度較高比較穩(wěn)定，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，被廣泛應(yīng)用，但是其他種類的基本培養(yǎng)基在麻瘋樹的組織培養(yǎng)中是否會(huì)具有比MS培養(yǎng)基更高的效率呢，比如WPM培養(yǎng)基，被譽(yù)為木本植物培養(yǎng)基，是否會(huì)更適合麻瘋樹的組織培養(yǎng)？為了探究其他種類基本培養(yǎng)基在麻瘋樹組織培養(yǎng)中的表現(xiàn)，為麻瘋樹的組織培養(yǎng)研究做一個(gè)補(bǔ)充，本研究以麻瘋樹無菌苗為外植體使用了幾種基本培養(yǎng)基進(jìn)行麻瘋樹的組織培養(yǎng)。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

麻瘋樹種子采自云南金沙江邊干熱河谷區(qū)，4℃條件下保存于西南林業(yè)大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硝酸鈣、碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、甘氨酸、升汞，均為分析純?cè)噭?；白砂糖；卡拉膠。

BS223S型電子天平（0.001g），Sartoruis；SX－500滅菌鍋，TOMY；BCD－196電冰箱，美菱；MW－2070M微波爐，海爾；SW－CJ－2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；1810－B型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器，江蘇省宜興市勤華石英玻璃儀器廠；YBOFB2型空調(diào)，格力；T836W／765型日光燈，F(xiàn)SL佛山照明；LL－200P型電磁爐，佛山市順德區(qū)勞萊斯電器有限公司。其他工具還有移液槍，燒杯，量筒，容量瓶，玻璃棒，漏斗、剪刀、解剖刀、鑷子、酒精燈等。

2.2 方法

2.2.1 外植體表面消毒

將麻瘋樹成熟飽滿種子去殼后在次氯酸鈉與水1∶1的混合溶液中浸泡20 min，期間適當(dāng)攪拌，接著流水沖洗干凈種子表面的次氯酸鈉，放入清水中備用。將處理好的種子放入超凈工作臺(tái)，首先使用75%酒精浸泡30 s，使用無菌水清洗3遍，每次浸泡3 min左右，去除殘留酒精。然后在0.1%的升汞溶液中浸泡15 min后用無菌水清洗3次，每次3～5 min，盡可能洗去升汞殘留。將消毒完成的種仁，放入無菌水中備用。

2.2.2 無菌苗的萌發(fā)

沿種仁縱軸切開，除去胚乳，小心取出完整的幼胚，胚軸向下接種于MS、LM、WPM、N6這4種基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中不添加任何外源植物激素。每種培養(yǎng)基20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)一個(gè)幼胚，觀察各培養(yǎng)基中無菌苗的生長(zhǎng)情況，15 d內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

取15 d苗齡的麻瘋樹，子葉和真葉切割為1 cm×1 cm大小，下表面接觸培養(yǎng)基接入培養(yǎng)基上，胚軸橫向切割為1 cm左右長(zhǎng)短橫放于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為MS／WPM／N6／LM＋BA1.0mg／L＋I(xiàn)BA0.5mg／L＋TDZ0.1 mg／L，pH 值5.8。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每種培養(yǎng)基15～20個(gè)外植體，觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況，4周內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.2.4 不定芽的分化

將健康的愈傷組織切成小塊接種到培養(yǎng)基MS／WPM／N6／LM＋BA3.0 mg／L＋I(xiàn)BA0.5 mg／L＋GA31 mg／L上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15～20個(gè)外植體，觀察愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的時(shí)間、形態(tài)、數(shù)量等，4周內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。4周后，將叢生的不定芽分成2株一叢，轉(zhuǎn)接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使其繼續(xù)增殖。

2.2.5 不定芽的伸長(zhǎng)

將健康并且株高在2 cm以下的不定芽，轉(zhuǎn)入不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基 MS／WPM／N6／LM＋BA 0.1mg／L＋I(xiàn)BA 0.2 mg／L，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每種培養(yǎng)基15～20個(gè)外植體，觀察不定芽抽長(zhǎng)的長(zhǎng)度和長(zhǎng)勢(shì)等，測(cè)量其株高平均值變化，4周內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.2.6 生根誘導(dǎo)

將株高在2.5 cm以上的再生苗接入不添加任何外源植物激素的4種基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周，降低苗體內(nèi)激素水平，之后接入培養(yǎng)基1／2（MS／WPM／N6／LM）＋NAA0.5 mg／L＋I(xiàn)BA0.2 mg／L進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每種培養(yǎng)基15～20個(gè)外植體。觀察記錄生根的數(shù)量、長(zhǎng)度、形態(tài)，4周內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

若沒有特別說明，培養(yǎng)條件都是25±2℃，光照周期16 h／d，光照強(qiáng)度3 000lx。

3 結(jié)果及結(jié)論

3.1 無菌苗的萌發(fā)

4種培養(yǎng)基中無菌苗的萌發(fā)率都比較高，而且比較健康，推測(cè)是因?yàn)樽尤~貯存了一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是各培養(yǎng)基中無菌苗生長(zhǎng)狀況有所不同。N6培養(yǎng)基中的幼胚胚根最先長(zhǎng)出，MS和WPM稍晚一些，LM培養(yǎng)基中最晚，各培養(yǎng)基中胚根都比較健康，呈白色，數(shù)量一般3～5根。子葉均比較肥厚，脈絡(luò)清晰，N6培養(yǎng)基中無菌苗莖干最為粗壯，平均株高最高，真葉出現(xiàn)的時(shí)間也較早，第8 d出現(xiàn)第一片真葉，LM依然是最后出現(xiàn)真葉的，但是各培養(yǎng)基中無菌苗長(zhǎng)出的真葉，基本無畸形葉，并且葉脈清晰。各培養(yǎng)基中無菌苗萌發(fā)情況見表1。

表1 4種培養(yǎng)基中無菌苗萌發(fā)情況

3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

接種一周左右，外植體邊緣、末端開始膨大、卷曲，逐漸增厚，顏色漸漸變淺，出現(xiàn)淡黃綠色、淺綠色或者白色疏松、較致密愈傷組織。白色的愈傷組織在后續(xù)的培養(yǎng)中容易褐化死亡，不易分化出不定芽；淡黃綠色和淺綠色疏松愈傷組織的不定芽分化率比較低，并且芽苗比較矮小，莖段較細(xì)；淺綠色較致密愈傷組織分化不定芽能力比較強(qiáng)，并且在一段時(shí)間的培養(yǎng)之后在邊緣有出現(xiàn)芽點(diǎn)。MS和WPM培養(yǎng)基中子葉愈傷組織大多呈淺綠色，較致密，并且出現(xiàn)的芽點(diǎn)較多，有的莖段直接誘導(dǎo)出了小苗，N6培養(yǎng)基和LM培養(yǎng)基中幾乎沒有出現(xiàn)芽點(diǎn)，愈傷組織也不如MS和WPM培養(yǎng)基中的多。4種培養(yǎng)基中外植體愈傷誘導(dǎo)情況見表2。

表2 4種培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)情況

3.3 不定芽的誘導(dǎo)

接種一周左右，愈傷組織開始出現(xiàn)隆起，個(gè)別隆起會(huì)分化出正常的不定芽，其他的隆起或者一直是突起狀態(tài)或者形成畸形芽，畸形芽莖干很粗，沒有葉片或者葉片很小容易脫落，可能是由于細(xì)胞分裂素濃度太高的原因。4種培養(yǎng)基中，WPM培養(yǎng)基中不定芽分化數(shù)量最多，并且平均株高比較高，幼苗葉片翠綠，葉脈清晰，葉形正常，LM培養(yǎng)基中不定芽分化比較少，并且比較弱小（見圖1）。各培養(yǎng)基中不定芽分化情況見表3。

表3 4種培養(yǎng)基中不定芽分化情況

3.4 不定芽抽長(zhǎng)誘導(dǎo)

經(jīng)過抽長(zhǎng)培養(yǎng)，各培養(yǎng)基中的組培苗都有一定程度的抽長(zhǎng)，4種培養(yǎng)基中不定芽的伸長(zhǎng)并沒有很大的差異，都在1 cm左右，可見在抽長(zhǎng)培養(yǎng)中，主要起作用的是激素。

3.5 生根誘導(dǎo)

培養(yǎng)2周后，LM和WPM培養(yǎng)基中幼苗最先出現(xiàn)幼根，基本在3條左右。4周后，MS生根率大致為60%，LM和WPM都達(dá)到90%以上，N6生根誘導(dǎo)率最低，為34%。LM培養(yǎng)基中幼苗主根發(fā)達(dá)，粗壯，側(cè)根很少；WPM培養(yǎng)基中的幼苗主根數(shù)量較少，側(cè)根很發(fā)達(dá)；MS培養(yǎng)基中的幼苗主根短粗，少側(cè)根；N6培養(yǎng)基中的主根數(shù)量較少，并且比較短，其上有側(cè)根的突起（見圖2）。各培養(yǎng)基中不定芽生根情況見表4。

表4 4種培養(yǎng)基中幼苗生根情況

圖1 不定芽的誘導(dǎo)情況

圖2 幼苗生根情況

綜合以上情況，筆者認(rèn)為在以麻瘋樹無菌萌發(fā)苗作為外植體時(shí)，WPM培養(yǎng)基更為適合麻瘋樹的組織培養(yǎng)，在各階段的表現(xiàn)都比較穩(wěn)定。

4 展望

麻瘋樹的組織培養(yǎng)研究現(xiàn)在存在的主要問題在于重復(fù)性比較低，難以用于大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)，缺少一個(gè)高效、穩(wěn)定的再生體系，還需要研究者們進(jìn)一步的進(jìn)行研究。麻瘋樹現(xiàn)在已經(jīng)成為生物能源的研究熱點(diǎn)，但是其低產(chǎn)量仍然是困擾各國(guó)學(xué)者的一大難題，許多學(xué)者在提高其產(chǎn)量方面進(jìn)行了非常多的研究，今后的研究重點(diǎn)應(yīng)該是集中在其性別分化機(jī)制及雌雄花比例方面，從分子、細(xì)胞、組織培養(yǎng)等各種方面研究促進(jìn)其雌雄花比例升高，以提高結(jié)實(shí)率，以提高產(chǎn)油量，緩解能源危機(jī)。

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