章瓊燕，趙勝男，王 磊，黃 丹，翁微微，盛偉琪

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 20032

腫瘤出芽計(jì)數(shù)在預(yù)測(cè)T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用價(jià)值

章瓊燕，趙勝男，王 磊，黃 丹，翁微微，盛偉琪

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 20032

盛偉琪，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)青年委員，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)淋巴瘤專(zhuān)業(yè)委員會(huì)青年委員，上海市抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)副主任委員兼秘書(shū)長(zhǎng)。1992年畢業(yè)于原上海醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)系獲醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位，2001年獲復(fù)旦大學(xué)研究生院碩士學(xué)位，同年獲得日本產(chǎn)業(yè)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位。1992年至今就職于復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，從事腫瘤外科病理的診斷和研究，尤其是胃腸道腫瘤和惡性淋巴瘤的診斷、鑒別診斷及其相關(guān)研究。1999—2001年在日本產(chǎn)業(yè)醫(yī)科大學(xué)第一病理部作為訪問(wèn)學(xué)者進(jìn)行腫瘤分子和遺傳學(xué)研究的學(xué)習(xí)和工作。曾在Annals of Oncology、Journal of Pathology、American Journal of Clinical Pathology、Human Pathology、Cancer Genetics and Cytogenetics和Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology等雜志發(fā)表論文數(shù)十篇。承擔(dān)和參與多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和上海市科委研究項(xiàng)目。

背景與目的：腫瘤出芽是結(jié)直腸癌的不良預(yù)后因素。本研究使用10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)的方法評(píng)價(jià)腫瘤出芽，并分析其在預(yù)測(cè)T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：通過(guò)計(jì)數(shù)307例T1期結(jié)直腸癌10個(gè)高倍鏡視野下腫瘤出芽個(gè)數(shù)，參比臨床病理特征，建立T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)分析公式，并在14例新病例中對(duì)該公式進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化水平、脈管侵犯和腫瘤出芽個(gè)數(shù)與T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。統(tǒng)計(jì)分析得出的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)分析公式為：Z=1.571×（脈管狀態(tài)：侵犯為1；無(wú)侵犯為0）+2.661×（腫瘤分化：高級(jí)別為1；低級(jí)別為0）+0.024×（腫瘤出芽個(gè)數(shù)）-3.885，概率=1/1+e-Z。在14例新病例中得到了驗(yàn)證。結(jié)論：通過(guò)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野下的腫瘤出芽個(gè)數(shù)，可以精確地評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而協(xié)助臨床作出合理的決策。

腫瘤出芽；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；結(jié)直腸癌；風(fēng)險(xiǎn)分析公式

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，全球每年有超過(guò)120萬(wàn)的新發(fā)病例，60萬(wàn)人死于該疾?。?］。腸鏡檢查能夠發(fā)現(xiàn)較小的早期病變，通過(guò)早期干預(yù)治療可獲得較好預(yù)后。早期結(jié)直腸癌是指腫瘤局限于黏膜層或者黏膜下層的病變。這部分患者可選擇腫瘤局部切除［2］，如內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)、內(nèi)鏡下黏膜下層剝除術(shù)及經(jīng)肛門(mén)內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)等，都可完整切除早期病變。文獻(xiàn)報(bào)道的限于黏膜層的病變幾乎不發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而黏膜下層浸潤(rùn)的T1期腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例為6.8%～17.8%［3-5］。目前，臨床缺乏預(yù)測(cè)腫瘤局部切除后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效手段。如何準(zhǔn)確評(píng)判腫瘤局部切除術(shù)后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是一個(gè)關(guān)系患者后續(xù)治療方案選擇的難題。有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ期結(jié)直腸癌中腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后顯著相關(guān)［6-7］。然而，在早期結(jié)直腸癌中，腫瘤出芽能否預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移尚無(wú)深入研究。

腫瘤出芽是指在腫瘤的浸潤(rùn)前沿散在分布于間質(zhì)中單個(gè)或者小于5個(gè)的小簇腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽是腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征性標(biāo)志，是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因素，與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-13］。對(duì)于腫瘤出芽的評(píng)判方法目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同研究采用不同的方法計(jì)數(shù)腫瘤出芽，計(jì)量方法包括：定性、定量、或者半定量法；計(jì)量范圍包括：最密集區(qū)計(jì)數(shù)、腫瘤浸潤(rùn)前沿計(jì)數(shù)或整個(gè)腫瘤組織平均計(jì)數(shù)［6，8，14-16］。

在本研究中，我們使用10個(gè)高倍鏡視野的方法計(jì)數(shù)腫瘤出芽，通過(guò)建立淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)分析公式，客觀評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率，探索其在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集2008年1月—2014年4月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受根治性手術(shù)治療的T1期結(jié)直腸癌患者307例。另選取2014年8月后在我院手術(shù)治療的T1期結(jié)直腸癌患者14例作為驗(yàn)證組。研究排除Lynch綜合征、炎性反應(yīng)性腸病和同期或曾患有進(jìn)展期結(jié)直腸癌的病例。

1.2 研究方法

本研究從臨床病史和病理報(bào)告中收集患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。由具有胃腸病理學(xué)專(zhuān)長(zhǎng)的病理科醫(yī)師復(fù)習(xí)所有病理切片，評(píng)估腫瘤出芽和相關(guān)病理特征。

腫瘤出芽的評(píng)價(jià)方法：低倍鏡下（×100）瀏覽每個(gè)病例的所有HE染色切片，在腫瘤浸潤(rùn)的前沿尋找出芽最密集的區(qū)域，在該區(qū)域計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野（×400）下總的出芽個(gè)數(shù)。如果在低倍鏡下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的出芽區(qū)域，則隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野來(lái)計(jì)數(shù)出芽個(gè)數(shù)。

其他病理特征包括：腫瘤分化水平（低級(jí)別或高級(jí)別）、脈管侵犯（淋巴管或者血管）、黏膜肌狀態(tài)（可評(píng)估或不可評(píng)估）、黏膜下浸潤(rùn)深度（根據(jù)Kudo分類(lèi)分為SM1、SM2和SM3［17］）、生長(zhǎng)類(lèi)型（浸潤(rùn)型或膨脹型）及是否合并背景腺瘤。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用Mann-Whitney U/Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法來(lái)分析腫瘤出芽個(gè)數(shù)和病理特征之間的關(guān)系。使用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Logistic回歸等方法來(lái)分析組織病理特征和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn)的方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征

在307例患者中，男性159例，女性148例，男女比例1.1∶1.0。年齡27～86歲（中位年齡為60歲），平均59.8歲。腫瘤直徑6～93 mm，平均20 mm。病變分別位于右半結(jié)腸（39例）、左半結(jié)腸（64例）和直腸（204例）。平均每例的淋巴結(jié)數(shù)目為13枚。

2.2 病理特征

所有病例在10個(gè)高倍鏡視野下腫瘤出芽個(gè)數(shù)為0～138個(gè)，平均12個(gè)（圖1）。分析腫瘤出芽個(gè)數(shù)和組織病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽個(gè)數(shù)與腫瘤分化水平、黏膜下浸潤(rùn)深度、脈管侵犯、腫瘤生長(zhǎng)類(lèi)型、黏膜肌狀態(tài)和合并背景腺瘤顯著相關(guān)（表1）。

圖 1 結(jié)直腸癌生長(zhǎng)類(lèi)型Fig. 1 The growth type of colorectal cancer

表 1 腫瘤出芽與T1期結(jié)直腸癌臨床病理特征的聯(lián)系Tab. 1 Correlation of tumor budding with histopathological features in T1colorectal cancer

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析

統(tǒng)計(jì)分析顯示，13%的病例（40/137）出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。單因素分析顯示，腫瘤分化水平、脈管侵犯和腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（表2）。多因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤分化水平（HR=4.811，95%CI：3.943～5.870）、脈管侵犯（HR=14.315，95%CI：11.665～17.568）和10個(gè)高倍鏡計(jì)數(shù)的腫瘤出芽個(gè)數(shù)（HR=1.025，95%CI：1.018～1.031）與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（表2）。

2.4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分析公式的建立

在相同的腫瘤分化水平和脈管狀態(tài)下，腫瘤出芽個(gè)數(shù)越多，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率越大。根據(jù)Logistic回歸分析的結(jié)果，我們創(chuàng)建了一個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)分析公式：Z=1.571×（脈管狀態(tài)：侵犯為1；無(wú)侵犯為0）+2.661×（腫瘤分化水平：高級(jí)別為1；低級(jí)別為0）+0.024×（腫瘤出芽個(gè)數(shù)）-3.885，概率=1/1+e-Z。

2.5 公式的驗(yàn)證

14例驗(yàn)證病例的臨床病理特征見(jiàn)表3，通過(guò)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分析公式計(jì)算出相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)概率。3例淋巴結(jié)陽(yáng)性的病例公式計(jì)算出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)概率分別為0.615、0.302和0.349。11例淋巴結(jié)陰性的病例公式計(jì)算出的風(fēng)險(xiǎn)概率為0.020～0.023。

表 2 T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床病理單因素和多因素分析Tab. 2 Univariate and multivariate analysis of clinicopathological factors for T1colorectal cancer lymph node metastasis

表 3 驗(yàn)證組T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)比分析Tab. 3 Clinicopathological details of the validation group of the 14 cases of T1colorectal cancer

3 討 論

T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率較低，患者可以通過(guò)損傷相對(duì)較小的內(nèi)鏡下切除治療獲得根治。但是，一部分患者可能有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，本研究中T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為13%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（10%）相似［3-5］。內(nèi)鏡下局部切除后如何精確評(píng)估淋巴結(jié)狀態(tài)始終是臨床關(guān)注的問(wèn)題。但是，評(píng)估轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的病理標(biāo)準(zhǔn)尚未確立［18-19］。除了脈管侵犯和腫瘤分化水平這兩個(gè)已被廣泛接受的病理特征，腫瘤出芽已引起越來(lái)越多研究者的注意。一系列研究表明，腫瘤出芽與淋巴結(jié)侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤局部復(fù)發(fā)和較短的生存時(shí)間等顯著相關(guān)［8-13］。本研究通過(guò)對(duì)307例T1期結(jié)直腸癌患者進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，腫瘤出芽是預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要影響因素。因此，我們通過(guò)單因素和多因素回顧性分析發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽同樣是T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素，可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估客觀指標(biāo)之一，繼而為臨床后續(xù)治療方案的選擇提供參考。

病理切片中腫瘤出芽的判讀缺少標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)方法［6，8，14-16］，不同的研究采用的計(jì)數(shù)方法各不相同。其中使用最廣泛的是由Ueno等［10］提出的計(jì)數(shù)方法：在×20的物鏡下（放大倍數(shù)為×200）計(jì)數(shù)出芽最密集區(qū)域的腫瘤出芽個(gè)數(shù)，根據(jù)閾值判斷有否有腫瘤出芽。最近，Horcic等［6］比較了7種不同計(jì)數(shù)方法在105例Ⅱ期腸癌患者中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果顯示，10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)腫瘤出芽的方法具有較好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，觀察者之間一致性程度較高，并且獨(dú)立于T分期和脈管侵犯而與臨床結(jié)局顯著相關(guān)，因此建議使用該方法計(jì)數(shù)腫瘤出芽。Karamitopoulou等［16］的研究也推薦使用10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)的方法。我們的研究方法與Ueno等［10］的計(jì)數(shù)法類(lèi)似，通過(guò)低倍鏡下初篩直接計(jì)數(shù)出芽最密集區(qū)10個(gè)高倍鏡視野腫瘤出芽的具體個(gè)數(shù)。該計(jì)數(shù)方法一方面可避免腫瘤內(nèi)腫瘤出芽分布異質(zhì)性引起的選擇偏倚［20］，另一方面又可直接反映所選擇的區(qū)域腫瘤出芽個(gè)數(shù)減少統(tǒng)計(jì)偏差。因此，這種10個(gè)高倍鏡視野腫瘤出芽計(jì)數(shù)方法具有較好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

在結(jié)直腸癌研究中綜合各項(xiàng)危險(xiǎn)因素構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)分析公式，可以更加準(zhǔn)確客觀地評(píng)估不良事件的風(fēng)險(xiǎn)。Macias-Garcia等［21］通過(guò)對(duì)97例T1期結(jié)直腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤分化差、無(wú)蒂的形態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)分析模型來(lái)評(píng)估淋巴結(jié)狀態(tài)。此外，Masaki等［13，22］在T1和T2期結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，構(gòu)建了腫瘤出芽單因素的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分析公式。在后續(xù)驗(yàn)證病例中該公式可對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行預(yù)測(cè)，但是由于公式僅包含腫瘤出芽一個(gè)變量，不能反映其他因素對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的影響。我們的研究不僅對(duì)腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行分析，而且在多因素分析的基礎(chǔ)上建立多個(gè)變量的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分析公式，相關(guān)變量依據(jù)影響力進(jìn)行權(quán)重，依據(jù)算式，可計(jì)算出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率。在后續(xù)14例新病例的驗(yàn)證中，公式計(jì)算的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率與實(shí)際淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相吻合，提示該公式具有一定的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，在T1期結(jié)直腸癌中腫瘤出芽作為一個(gè)可量化的組織學(xué)指標(biāo)，與臨床病理特征密切相關(guān)。單因素和多因素分析顯示，10個(gè)高倍鏡視野下的腫瘤出芽個(gè)數(shù)與T1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。本研究演算出的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分析公式能有效地預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可協(xié)助臨床評(píng)估T1期結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

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The clinical significance of tumor budding in predicting lymph node metastasis of T1 colorectal cancer

ZHANG Qiongyan， ZHAO Shengnan， WANG Lei， HUANG Dan， WENG Weiwei， SHENG Weiqi（Department of Pathology， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China）

SHENG Weiqi E-mail: shengweiqi@163.com

Background and purpose: Tumor budding is a poor prognostic factor in colorectal cancer. In this study， we studied the tumor budding by counting the actual number in 10 high power fields and evaluated itsclinical application in predicting lymph node metastasis of T1colorectal cancer. Methods: Tissue specimens from 307 patients with histologically conf i rmed T1colorectal cancer were enrolled. The clinicopathological characteristics including tumor budding were evaluated for their predictive value in lymph node metastasis. A formula was created to calculate the risk score for prediction of lymph node metastasis which was validated by 14 new cases. Results: In the multivariate analysis， it showed that tumor grade， lymphovascular invasion and the number of tumor budding were signif i cantly associated with lymph node metastasis. The probability of lymph node metastasis was calculated using the following equations: Z=1.571×（lymphovascular state: invasion， 1； no invasion， 0）+2.661×（tumor grade: high grade，1； low grade， 0）+0.024×（budding counts）-3.885； Probability=1/1+e-Z. The high scores were correlated with the lymph node metastasis in the validations. Conclusion: We can accurately assess the risk of lymph node metastasis by counting the number of tumor budding in 10 high power fields. Therefore tumor budding could potentially assist treatment decision making in T1colorectal cancer patients with high-risk lymph node metastasis.

Tumor budding； Lymph node metastasis； Colorectal cancer； Risk score

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.11.005

R735.3

A

1007-3639（2015）11-0865-06

2015-05-08）

盛偉琪 E-mail：shengweiqi@163.com