王建明

（甘肅省莊浪縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 莊浪744699）

為探討豬瘟（CSF）、豬口蹄疫（FMD）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS） 三種疫苗同時分點免疫對種公豬精液品質的影響，以期減少精液生產中因免疫產生不良影響的頻次和持續(xù)時間優(yōu)化公豬免疫程序，保證精液質量。

1 材料

1.1 試驗豬只選擇 莊浪縣金鎖生豬養(yǎng)殖有限公司、恒達生豬養(yǎng)殖有限公司、良邑鄉(xiāng)良怡種公豬站選取杜洛克、長白、大約克3個品種且實驗前精液品質符合（GB/T25172-2010《豬常溫精液生產與保存技術規(guī)范》）要求的各項指標。

1.2 疫苗選擇 豬 0 型口蹄疫合成肽疫苗（2570+7309），申聯生物醫(yī)藥(上海)有限公司，批號：20140311001;豬瘟活疫苗（細胞源），中牧實業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，批號：201404062;豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（NVDC-JXA1株)洛昭普萊柯生物工程股份有限公司，批號：20140602。

1.3 儀器設備 精子密度儀、顯微鏡（帶恒溫載物臺）、電子天平、恒溫水浴鍋、美蘭染色液、計數器、、血球計數板、血蓋片、微量移液器、擦鏡紙、吸水紙、玻璃棒、捕豬器、注射器、真空采血管、量杯、量筒、美蘭染液、95%酒精、3.0%氯化鈉溶液、去離子水、75%酒精等。

2 方法

2.1 試驗豬分組及免疫方法 按品種選試驗豬30頭，分為3組：第1組（杜洛克組），10頭，編為D1-D10；第2組（長白組） ,10頭，編為C1-C10；第3組（大約克組） ,10頭編為Y1-Y10。

以上各組均口蹄疫合成肽疫苗頸部左側肌肉注射,豬瘟活疫苗頸部右側皮下注射,豬藍耳病疫苗于臀部肌肉注射,各種疫苗均按照使用說明書規(guī)定的劑量注射，規(guī)范操作。

各組免疫接種后臨床觀察24小時,免疫后每過6小時記錄觀察結果1次,重點觀察是否出現食欲減退、發(fā)熱、精神頹廢等輕微癥狀和死亡、流產、過敏性休克等強烈反應，同時備好地塞米松、腎上腺素等急救藥物，以防止試驗豬死亡。

2.2 免疫抗體監(jiān)測 免疫后第28天采集血清送莊浪縣疫控中心實驗室進行抗體檢測，豬瘟免疫抗體檢測采用正向間接血凝試驗，豬O型口蹄疫合成肽疫苗和豬藍耳疫苗免疫抗體檢測采用間接ELISA法。

2.3 精液品質監(jiān)測 在同時免疫CSF、FMD、PRRS疫苗前，以上各組每3天采集一次精液并進行精液品質監(jiān)測，共連續(xù)監(jiān)測20次。各組免疫后每3天采集一次精液并進行精液品質監(jiān)測，同樣連續(xù)監(jiān)測20次，主要監(jiān)測采精量、精子活力、精子密度、精子畸形率4個指標。

2.3.1 采精量監(jiān)測 為減少實際操作中因部分玻璃量具導致的誤差，每次精液采集完畢，及時過濾，再用電子天平稱取重量，按1g≈1m l換算體積。

2.3.2 精子活力監(jiān)測 取剛采鮮精，分別用微量移液器取25μl置于載玻片上并加蓋玻片，置于37℃恒溫載物臺上，用顯微鏡400倍觀察精子活力，每樣片觀察3個視野，并觀察不同液層內的精子運動狀態(tài)，進行計算。三個視野活力檢測的平均數按照M=(n1+n2+n3)/3式中：M--活力，%；n1--第一視野活力，%；N2--第二視野活力，%；N3--第三視野活力，%。

2.3.3 精子畸形率檢測 取精液一滴滴于載玻片一段，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片一段呈45°夾角，將樣品均勻的涂布于載玻片上，自然風干，每個樣品制作3個抹片；待風干后，將抹片侵入無水酒精中固定2～3min，取出風干；在風干的抹片上滴加美蘭染液2 3m l，染色3min；用蒸餾水沖洗干凈，風干；置于顯微鏡400～600倍下觀察200～500個精子，計算精子畸形率。計算方法：A=A1/A2×100%式中：A--畸形率，%；A1--畸形精子數，個；S--精子總數，個。

2.3.4 精子密度監(jiān)測 使用法國大歐公司CRYO-VET精子密度儀進行檢測，具體操作方法：按ON/OFF鍵打開機器；把加有精液稀釋液的參考樣品加入檢測杯內，按下松開“R”鍵，密度儀顯示0.00，此時精子密度儀歸零，取出參考樣品；再用另一只干凈量杯加入5ml新鮮精液進行測量；按下松開“T”鍵,顯示屏顯示所測量精液的吸光度，然后查隨機附帶的《豬精液吸光度-密度轉換表》即可檢出該精液的精子密度。

2.3.5 結果統計與分析方法 精液品質檢測的每項指標在免疫前和免疫后各有20個數據,然后將各項監(jiān)測數據按品種不同分免疫前和免疫后，用SPSS軟件進行方差分析與顯著性檢驗，在分析比較時用平均值(X)±標準差(SD)表述,用單因素方差分析法檢驗免疫前后各監(jiān)測指標間的差異顯著性。

3 結果與分析

3.1 免疫應激反應觀察結果 按上述方案免疫后，均未出現強烈應激反應。只有杜洛克組有1頭豬在注射疫苗6小時后出現輕度減食（副反應率0.67%） 經一段時間后恢復正常。因此說明三種疫苗同時免疫副反應發(fā)生較低。

3.2 同時免疫CSF、FMD、PRRS后抗體檢測結果 免疫后第28天檢測CSF、FMD、PRRS三種疫苗免疫抗體，均達到農業(yè)部要求的合格率70%以上。這可能與所選公豬免疫前基礎抗體的存在有關。

表1： 三種疫苗同時免疫后第28 天抗體合格率

3.3 采精量監(jiān)測結果 3個品種公豬注射疫苗前后精液量比較見表2。試驗結果表明，大約克種豬三種疫苗同時多點免疫后采精量顯著降低（P＜0.05），而長白和杜洛克豬在注射前后精液量無顯著差異。

表2： 3 個品種公豬注射疫苗前后精液量比較

3.4 活力監(jiān)測結果 活力監(jiān)測結比較發(fā)現，3個品種公豬在疫苗注射前后精子活力差異均不顯著（P＞0.05）。

3.5 畸形率監(jiān)測結果 3個品種公豬注射疫苗前后精子畸形率比較發(fā)現，大約克 長白 杜洛克三個品種公豬在同時免疫CSF、FMD、PRRS疫苗后精子畸形率顯著增加（P＜0.05），其中:大約克的畸形率增加了36.0%,直到免疫后第8次監(jiān)測（免疫后27天） 逐漸恢復至免免疫前水平;長白的畸形率增加了38.4%，直到免疫后第10次監(jiān)測（免疫后33天） 逐漸恢復至免免疫前水平；杜洛克畸形率增加了33.9%,直到免疫后第9次監(jiān)測（免疫后30天） 逐漸恢復至免免疫前水平。

表3： 3 個品種公豬注射疫苗前后精子活力比較

表4： 3 個品種公豬注射疫苗前后精子畸形率比較

3.6 密度監(jiān)測結果 3個品種公豬注射疫苗前后精子密度比較發(fā)現，3個品種公豬在疫苗注射前后精子密度差異均不顯著（P＞0.05）。

表5： 3 個品種公豬注射疫苗前后精子密度比較

4 討論

在豬的常溫精液生產中，采精量、精子活力、密度、畸形率是評價原精液是否合格的重要指標，根據本研究3種疫苗同時免疫后公豬精液品質持續(xù)監(jiān)測結果可以看出：長白與杜洛克采精量在免疫前后表現平穩(wěn)，前后差異不顯著（P＞0.05），這與張淑二[[[]張淑二，林雪，劉棟，等.注射口蹄疫疫苗對不同肉用品種種公牛精液品質的影響[J]中國草食動物.2011,31（4）：23-25.]]等人在O型口蹄疫疫苗免疫牛上的試驗結果一致，大約克豬在免疫前后采精量變化顯著（P＜0.05），這與瞳敬賓的研究，大約克豬在注射疫苗前后的精液量差異顯著（P<0.05），其他各品種注射前后差異精液量差異不顯著的結論完全一致[[[]佟敬賓.注射疫苗對種公豬精液品質的影響[J]豬業(yè)科學.2008,9:94-95.]]。這說明3種疫苗同時免疫對公豬采精量有一定影響。

精子活力和密度在3種疫苗免疫前后各品種變化均不顯著（P＞0.05） 這與汪澤華的研究，豬瘟疫苗引起的精子活力下降至10天后開始恢復，至14天完全恢復的結論不一致[[[]汪澤華.常規(guī)免疫注射對公豬精子活力的影響[J]河北畜牧獸醫(yī).2002,18（3）：19.]]，究其原因，可能是他的研究使用2種以上的滅活疫苗所致。

精子畸形率在3種疫苗同免疫后較免疫前有明顯增高（P＜0.05） 但是均沒有超過畸形率≤20%這一國家標準。

綜上，3種疫苗同時免疫后，公豬精子畸形率明顯增加，大約克采精量明顯下降，究其原因，是因為滅活疫苗生產中加入的氫氧化鋁等佐劑對豬體細胞的生物毒性引起。所選種公豬在免疫后第28天的抗體檢測中，各品種均表現出了較好的抗體水平是由于免疫CSF、FMD、PRRS疫苗前前一次免疫抗體存在所致。

根據(GB23238-2009《種豬常溫精液》 )對用于生產常溫精液的原精液要求是：采精量≥100ml、精子密度≥1億/ml、精子活力≥70%、精子畸形率≤20%，外觀乳白色，無膿性分泌物，無皮毛等異物，結合本試驗可知在種公豬的免疫上可以采用3種疫苗同時免疫。

5 結論

豬瘟活疫苗（細胞源）、豬口蹄疫O型合成肽疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（NVDC-JXA1株） 三種疫苗同時分點免疫種公豬，精子畸形率在免疫后有顯著上升，但精液品質符合常溫精液產品要求，并沒有超過國家標準，該方法能有效降低因免疫對精液品質造成的不良影響，減少影響頻次，縮短影響周期。在種公豬的免疫上是安全可行的。

[1] 張淑二，林雪，劉棟，等.注射口蹄疫疫苗對不同肉用品種種公牛精液品質的影響[J]中國草食動物.2011,31（4）：23-25.

[2]佟敬賓.注射疫苗對種公豬精液品質的影響[J]豬業(yè)科學.2008,9:94-95.

[3]汪澤華.常規(guī)免疫注射對公豬精子活力的影響[J]河北畜牧獸醫(yī).2002,18（3）：19.