王中杰， 王傳春， 蘇 丹， 劉建勝（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261061）

在養(yǎng)兔生產(chǎn)中，兔瘟(RHD)潛伏期短、發(fā)病急、死亡率高，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的損失。我國(guó)自行研制的兔瘟組織滅活苗對(duì)預(yù)防兔瘟的爆發(fā)起到了積極的作用，但也有一些地區(qū)的養(yǎng)兔場(chǎng)由于機(jī)體的整體免疫水平較低，經(jīng)過(guò)RHD疫苗免疫后仍發(fā)生本病，為了更好地提高免疫效果，降低兔瘟的發(fā)生，我們研制了中藥方劑兔穩(wěn)康來(lái)提高該疫苗的免疫效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中藥及疫苗 兔穩(wěn)康由防風(fēng)、黃芪、茯苓、白術(shù)組成（購(gòu)于北京同仁堂醫(yī)藥公司）。按配方比例稱(chēng)量粉碎，混勻過(guò)60目篩，塑料袋分裝密封備用，試驗(yàn)時(shí)按設(shè)計(jì)比例添加飼料中混均制成顆粒飼喂。RHD疫苗由山東濱州華宏生物制品有限責(zé)任公司饋贈(zèng)（批號(hào)131211）。人“O”型紅細(xì)胞由山東省濰坊市人民醫(yī)院化驗(yàn)科饋贈(zèng)。

1.1.2 RHD種毒 為山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院分離的自然野毒株。經(jīng)易感家兔傳代，無(wú)菌采取有典型病變的肝臟，反復(fù)凍溶后，用組織勻漿機(jī)絞碎，加生理鹽水稀釋成1﹕10的乳劑，加雙抗4℃冰箱過(guò)夜，－15℃低溫保存?zhèn)溆?。血凝效價(jià)（HA） 不低于1﹕2。

1.1.3 凝集抗原 取人工感染死亡兔肝組織，以PBS液作1﹕10倍稀釋勻漿，反復(fù)凍融3次，加1/3體積氯仿?lián)u均置室溫作用2h，離心20min，取上清液，以血凝試驗(yàn)（HA） 測(cè)定抗原凝集價(jià)，以最高凝集價(jià)除以4，即為4單位凝集抗原。

1.2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 試驗(yàn)兔由山東益嘉集團(tuán)蒙陰縣益達(dá)兔業(yè)有限公司提供，選擇40日齡未免疫的長(zhǎng)毛兔120只，隨機(jī)分為4組，每組30只。Ⅰ組為對(duì)照組，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為試驗(yàn)組。各組家兔頸部皮下接種RHD疫苗1ml/只，免疫前2天試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別飼喂添加1%、2%和4%中藥免疫增強(qiáng)劑“兔穩(wěn)康”[13，14，15]，連用7天，對(duì)照組不用藥。試驗(yàn)期間每天觀察記錄兔臨床癥狀，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

2.2 樣品的采取與處理 免疫后20天每只兔心臟采血10mL，然后分別放入加有肝素抗凝劑和無(wú)抗凝劑的干燥滅菌小試管內(nèi)（分離血清） 測(cè)定血凝抗體水平和T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率。

T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率的測(cè)定方法、結(jié)果判定方法與標(biāo)準(zhǔn)參照何昭陽(yáng)等老師編寫(xiě)的《動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》 （2002版）；血凝抗體的檢測(cè)方法與步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：用SPASS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 兔穩(wěn)康對(duì)兔T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率的影響 兔穩(wěn)康對(duì)T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率的影響結(jié)果見(jiàn)表1。在兔瘟疫苗免疫前以高、中、低劑量添加飼喂中藥免疫增強(qiáng)劑兔穩(wěn)康，20天后均能顯著提高其T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率，即試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ組之間比較差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于Ⅱ組（P＜0.05）。故以2.0%劑量添加兔穩(wěn)康飼喂較合適。T淋巴細(xì)胞染色見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4。

表1 T 淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率 （%）

圖1：對(duì)照組血液T淋巴細(xì)胞

圖2：Ⅱ組血液T淋巴細(xì)胞

圖3：Ⅲ組血液T淋巴細(xì)胞

圖4：Ⅳ組血液T淋巴細(xì)胞

3.2 兔穩(wěn)康對(duì)兔瘟HI抗體的影響 中藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)兔HI抗體的影響結(jié)果見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)分析表明，在兔瘟疫苗免疫時(shí)以高、中、低劑量添加中藥免疫增強(qiáng)劑兔穩(wěn)康，第20天測(cè)定血液中HI抗體水平，均能顯著提高試驗(yàn)組，即試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組Ⅰ比較差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組與試驗(yàn)Ⅱ組之間比較差異顯著（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組之間比較差異不顯著（P＞0.05）。故以2.0%劑量添加中藥制劑飼喂較適宜。

表2 HI 抗體水平檢測(cè)結(jié)果 （log2）

4 討論

自擬方劑兔穩(wěn)康由防風(fēng)、黃芪、茯苓、白術(shù)四味藥物組成，黃芪、白術(shù)都具有補(bǔ)脾益氣的作用，現(xiàn)代研究表明黃芪有強(qiáng)心作用，并對(duì)痢疾桿菌、溶容血性鏈球菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌等有抑制作用；白術(shù)利尿、輕度降血糖作用；茯苓能滲濕利尿，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等有抑制作用，四藥合用，共同起到健脾益氣、利水滲濕的作用。

表1表明，兔穩(wěn)康可以提高機(jī)體的T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率，這與其健脾益氣的功效有關(guān)，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。試驗(yàn)時(shí)我們還檢測(cè)了兔子的HI抗體水平，試驗(yàn)組的抗體有效滴度明顯高于對(duì)照組，雖然HI抗體與保護(hù)性抗體不是同一種抗體，但兩者之間有平行消長(zhǎng)關(guān)系，因此檢測(cè)HI抗體效價(jià)可間接的推測(cè)保護(hù)性抗體水平。兔穩(wěn)康可以作為RHD疫苗的免疫增強(qiáng)劑，以2.0%劑量添加較為合適。