韓曉燕 汪偉民

·基礎(chǔ)研究·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其對(duì)大鼠血液指標(biāo)的影響

韓曉燕 汪偉民

目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的體外培養(yǎng)以及其不同濃度對(duì)大鼠血液指標(biāo)的作用。 方法 體外培養(yǎng)hUC-MSCs，將SPF級(jí)SD雌性大鼠45只,平均體質(zhì)量為(200±10)g,隨機(jī)均分為5組：低、中、高濃度細(xì)胞移植組，生理鹽水組，空白對(duì)照組，其中，低濃度為(0.5×106/mL)、中濃度為(1×106/mL)、高濃度為(2×106/mL)、生理鹽水組(0.9 % NS)。將培養(yǎng)成功的hUC-MSCs配比成相應(yīng)的濃度，各取1 mL經(jīng)過(guò)大鼠尾靜脈輸注到大鼠體循環(huán)內(nèi)，空白對(duì)照組不做任何處理；分別按注射后1 d，5 d，10 d時(shí)間順序，每次分別隨機(jī)抽取5組中1個(gè)亞組的大鼠處死以收集腹主動(dòng)脈內(nèi)血液，檢測(cè)其血常規(guī)及生化指標(biāo)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，了解hUC-MSCs對(duì)大鼠血常規(guī)、生化指標(biāo)是否存在影響。 結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集胎兒臍帶成功在體外培養(yǎng)出hUC-MSCs。另將不同濃度的hUC-MSC經(jīng)大鼠尾靜脈輸注大鼠體循環(huán)內(nèi)，血液數(shù)值上得到：① 大鼠白細(xì)胞隨hUC-MSCs濃度的升高而升高，且各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其數(shù)值隨時(shí)間的改變沒(méi)有降低；② 大鼠總膽紅素在1 d后出現(xiàn)增高，低濃度組表現(xiàn)顯著，隨時(shí)間推移恢復(fù)正常。 結(jié)論 hUC-MSCs可在體外成功分離培養(yǎng)；經(jīng)大鼠尾靜脈輸注大鼠體循環(huán)內(nèi)，可引起白細(xì)胞的升高和總膽紅素的一過(guò)性升高。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 體外培養(yǎng)； 尾靜脈注射； 大鼠

眾多骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究結(jié)果表明，因其取材方便，易于分離培養(yǎng)，擴(kuò)增迅速，多向分化潛能以及具有向損傷處遷移的眾多優(yōu)勢(shì)而日益受到人們的關(guān)注[1]，逐步從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用轉(zhuǎn)向臨床。研究人員努力實(shí)踐其應(yīng)用于臨床的可行性，其中包括多能分化潛力、免疫原性、修復(fù)能力等[2]，并涉入到造血功能重建、心臟系統(tǒng)疾病、免疫風(fēng)濕改善等各類學(xué)科[3-5]。近年來(lái)，科研進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)人類臍帶中的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖數(shù)量遠(yuǎn)多于骨髓及外周血[6]，從中分離出人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)更簡(jiǎn)易，含量更多[7-9]，并有報(bào)道[10，11]，骨髓MSCs隨著年齡的增長(zhǎng)數(shù)量將明顯減少，為追求更適宜的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源，人們將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至hUC-MSCs。本文著重探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及對(duì)大鼠的血液指標(biāo)的影響，并觀察注射后大鼠有無(wú)嚴(yán)重的排斥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞：在無(wú)菌條件下取足月剖宮產(chǎn)的健康胎兒臍帶組織；②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)SD雌性大鼠45只，6周齡，體質(zhì)量(200±10)g，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。③實(shí)驗(yàn)試劑：α-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)；水合氯醛(深圳三利化學(xué)制品有限公司)；苦味酸(武漢福德化工有限公司)。④實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備：DK-8D型電熱恒溫水槽(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)； SW-CJ-1ED型凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；BH75-HERA cell 150培養(yǎng)箱(克勒格瓦尼(上海)分析儀器有限公司)；IX70顯微鏡(奧林巴斯)；臺(tái)式離心機(jī) LDZ5-2(康源科技)；全自動(dòng)生化分析儀RL7600D(瑞士羅氏公司)；血常規(guī)分析儀SYMEX XE-2100(日本東亞公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的體外培養(yǎng)及擴(kuò)增 本實(shí)驗(yàn)hUC-MSCs體外培養(yǎng)的原理是干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)瓶的較強(qiáng)貼壁能力。在無(wú)菌條件下取足月剖宮產(chǎn)的健康胎兒臍帶組織，2 h內(nèi)用含200 U/mL青、鏈霉素的磷酸緩沖液(PBS PH=7.4)反復(fù)沖洗去除表面的血液成分，用無(wú)菌剪刀剔除臍動(dòng)、靜脈后主要是取臍帶的華爾通膠-又稱臍帶基質(zhì)，在含少量PBS下將臍帶組織切割成體積約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，隨后放入無(wú)菌試管中加1% 膠原酶Ⅱ 37℃消化2 h，中間間斷震蕩混勻，再加入2.5% 胰酶 3～5 mL繼續(xù)消化30 min后加入血清3～5 mL終止，用200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織。將過(guò)濾液用PBS稀釋，使用臺(tái)式離心機(jī)以2 500 r/min離心20 min。棄除上層液體，將底層沉淀物再次稀釋，繼續(xù)以2 000 r/min離心20 min，收集離心沉淀細(xì)胞，細(xì)胞板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將分離的細(xì)胞調(diào)整密度為5×105/cm2接種于T25的培養(yǎng)瓶中。接種前在培養(yǎng)瓶中加入α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、2 mmol/L谷胺酰胺、5 ng/mL EGF)。置于含有5%～6% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～1.5 h后取出，可見組織細(xì)胞已經(jīng)粘附在培養(yǎng)皿底部，沿邊緣緩慢加入DMEM/F12+FBS (不能沖起貼壁組織)，讓培養(yǎng)基緩慢蔓延整個(gè)培養(yǎng)體系。48～72 h后細(xì)胞換液，去除非貼壁細(xì)胞，以后每3天換液1次，換液過(guò)程中避免沖擊貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及克隆形成情況，細(xì)胞融合80%～90%后使用2.5%胰酶在37℃下消化1～2 min鏡下觀察hUC-MSCs由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形并從培養(yǎng)瓶底漂浮起來(lái)后，加入所用胰酶量的4～5倍(4～5 mL EME培養(yǎng)基)進(jìn)行終止胰酶對(duì)hUC-MSCs的消化, 用無(wú)菌移液管將從培養(yǎng)瓶底部消化下來(lái)的hUC-MSCs混懸液移至15 mL的離心管中，在1 200 rpm下離心5 min后可見管底少許白色細(xì)胞層(即hUC-MSCs), 用無(wú)菌移液管移棄上層離心液體并留取白色細(xì)胞層，再加入12 mL EME培養(yǎng)基緩慢吹打均勻，以1 ∶2或1 ∶3平均分裝在培養(yǎng)瓶中，鏡下觀察后再將其放至在37℃，5%～6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞總數(shù)達(dá)到31.5×106時(shí)，調(diào)整好hUC-MSCs濃度，配成低、中、高3個(gè)不同濃度組：低劑量(0.5×106/mL)實(shí)驗(yàn)組、中劑量(1×106/mL)實(shí)驗(yàn)組、高劑量(2×106/mL)實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 按隨機(jī)分配原則，將45只SD大鼠分為空白對(duì)照組(K1)，生理鹽水組(K2)，低、中、高濃度3組(S1、S2、S3)各9只。隨后再將各組隨機(jī)分為3個(gè)亞組(K11、K12、K13；K21、K22、K23；S11、S12、S13；S21、S22、S23；S31、S32、S33)，每個(gè)亞組3只。在不同濃度組的hUC-MSCs中各抽取1 mL hUC-MSCs，經(jīng)大鼠尾靜脈分別注射各實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)生理鹽水組將1 mL的0.9% NS經(jīng)尾靜脈注射，注射后用碘伏消毒輸注部位，以防局部感染?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行任何注射。將每組大鼠分別用苦味酸在身體不同的部位做標(biāo)記(低濃度組為右前肢，中濃度組為右后肢，高濃度組為左后肢)，再將大鼠放入鼠籠中，注意保暖、大鼠的飼料(以每只30 g/d供應(yīng)，水隨意供應(yīng))，每天觀察。

1.2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè) 按注射后按1 d，5 d，10 d時(shí)間順序每次分別隨機(jī)抽取5組中1個(gè)亞組，將大鼠處死后收集腹主動(dòng)脈內(nèi)血液10 mL分別放入相應(yīng)試管內(nèi)(血常規(guī)管、生化管)。具體操作步驟如下：①準(zhǔn)備好2把無(wú)菌鑷子、2把止血鉗、1把手術(shù)刀。10%水合氯醛，以及送檢所需的血常規(guī)、生化試管。②用10%水合氯醛注入大鼠腹腔內(nèi)將大鼠麻醉(水合氯醛的用量為大鼠體質(zhì)量的0.3%)。③用棉線將大鼠的頭部和四肢固定在動(dòng)物臺(tái)上，用手術(shù)刀將大鼠的腹部皮膚打開，再用組織鉗將腹部肌肉逐步打開，直至暴露出腹主動(dòng)脈和腹主靜脈。④找出腹主動(dòng)脈后抽取血液，將所需檢查的試管裝至所需量后立即送往實(shí)驗(yàn)室檢查血液生理指標(biāo)，得出結(jié)果?？偣卜?次將大鼠全部處理完畢。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs體外培養(yǎng) 首次換液前培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)有大量懸浮細(xì)胞，主要為圓形紅細(xì)胞(見圖1a)。首次換液后，可見部分細(xì)胞已貼壁，胞體呈圓形或多邊形，漂浮的不貼壁細(xì)胞大部分隨換液除去；培養(yǎng)3 d，貼壁細(xì)胞胞體明顯增大并開始分裂增殖，細(xì)胞形態(tài)漸變?yōu)樗笮位蚣忓N形，呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，形成大小不一的集落。7天時(shí)，細(xì)胞變成長(zhǎng)梭形，基本形成明顯克隆，細(xì)胞分裂增殖明顯，胞漿豐富，核大，呈橢圓形。在10～14天，培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底的80%～90%并融合，呈漩渦狀或輻射狀排列，細(xì)胞變得扁平，胞體狹長(zhǎng)，核呈橢圓形。分瓶傳代培養(yǎng)的細(xì)胞初始呈圓形，2～4 h貼壁伸展，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，均勻性分布生長(zhǎng)，細(xì)胞增多匯合呈漩渦狀或輻射狀排列，少數(shù)細(xì)胞為三角形、多角形，胞核呈圓形或橢圓形。傳代培養(yǎng)的BMSC在形態(tài)學(xué)上更加趨于一致，為成纖維細(xì)胞樣(見圖1b)。

2.2 大鼠血液指標(biāo)分析

2.2.1 大鼠白細(xì)胞數(shù)據(jù)分析 hUC-MSCs經(jīng)大鼠尾靜脈輸注至體循環(huán)內(nèi)后，在不同濃度組不同時(shí)間點(diǎn)采集大鼠腹主動(dòng)脈血進(jìn)行WBC、RBC、PLT、ALT、AST、TBIL、LDH、CPK、BUN測(cè)定；將其血液指標(biāo)采用one-way anova進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。低、中、高3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組之間的WBC數(shù)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且分別與自生理鹽水組、正常對(duì)照組的WBC數(shù)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白細(xì)胞數(shù)值隨濃度增高而增多，隨時(shí)間的推移并未減少。見圖2。

2.2.2 大鼠直接膽紅素?cái)?shù)據(jù) 低濃度組較其他各濃度組有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨時(shí)間推移而逐步恢復(fù)正常。見圖3。

3 討論

近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞在治療細(xì)胞、臟器損傷性疾病和器官修復(fù)等方面成為研究熱點(diǎn)，這也為臨床治療提供有利的基礎(chǔ)。而臨床應(yīng)用中最常見的突出問(wèn)題即是免疫排斥和致瘤性。研究[12-16]表明，間充質(zhì)干細(xì)胞僅低表達(dá)MCH-Ⅰ而不表達(dá)MCH-Ⅱ，并缺乏共刺激分子CD80，CD86和CD40[12]，不能誘導(dǎo)異體或異種淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)而阻斷了抗原識(shí)別，抗原呈遞等一系列免疫應(yīng)答，減輕排斥反應(yīng)增加移植成功率，并降低了移植物抗宿主疾病的發(fā)生，同時(shí)該細(xì)胞無(wú)致瘤性。故本實(shí)驗(yàn)利用hUC-MSCs對(duì)鼠類進(jìn)行異種移植,且采用大鼠尾靜脈輸注。經(jīng)過(guò)輸注不同濃度hUC-MSCs，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察相關(guān)血液指標(biāo)，得出：hUC-MSCs可引起大鼠白細(xì)胞增高?？紤]一方面該實(shí)驗(yàn)是異種移植，可能由于種族之間存在炎性應(yīng)激保護(hù)自身機(jī)體而引起[17]；另一方面大量文獻(xiàn)[18-24]提示干細(xì)胞參與機(jī)體免疫應(yīng)答，白細(xì)胞的增多可能是干細(xì)胞免疫答應(yīng)過(guò)程的表現(xiàn)，同時(shí)雖出現(xiàn)大鼠膽紅素增高，但是根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，增高為一過(guò)性可自行恢復(fù)正常，對(duì)肝臟其他功能指標(biāo)并未引起異常。通過(guò)該結(jié)果也間接證實(shí)hUC-MSCs在肝臟內(nèi)發(fā)揮作用，且在體循環(huán)中存活。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠在接受靜脈注射后，飲食、活動(dòng)及生命體征均保持正常，未出現(xiàn)腹瀉、抽搐、死亡等現(xiàn)象，其操作性得到肯定，安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)不同的時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的數(shù)據(jù)，得出：hUC-MSCs可引起大鼠體內(nèi)白細(xì)胞的升高和直接膽紅素的一過(guò)性升高；其他血液指標(biāo)未見明顯差異性改變(P>0.05)。另在細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：① hUC-MSCs在37℃，6%的CO2濃度的培養(yǎng)箱中較37℃，5.5%的CO2濃度的培養(yǎng)中生長(zhǎng)更加旺盛,CO2的濃度是否對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)有一定的作用，還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；② 直接使用2.5%胰酶進(jìn)行消化貼壁細(xì)胞時(shí)鏡下觀察，可見hUC-MSCs迅速由梭形變成圓形，即使立即終止消化仍會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)延遲或不增；隨后傳代時(shí)改用2.5%胰酶加配等量PBS液進(jìn)行稀釋，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂速度明顯改善?？紤]可能是原濃度胰酶對(duì)細(xì)胞消化過(guò)快，不易掌控終止時(shí)間，同時(shí)濃度高對(duì)干細(xì)胞損傷較大，影響細(xì)胞貼壁分裂生長(zhǎng)。③ 鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)大量聚集在培養(yǎng)瓶的兩面交匯處(分裝的每瓶都出現(xiàn)此類現(xiàn)象)，究竟是何原因，有待今后實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探討。

[1] Huang KL, Wu XM, Wang XY, et al. The effect of marrow mesenchymal stem cell transplantation on pulmonary fibrosis in rats[J]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2012,35(9):659-664.

[2] Song N, Armstrong AD, Li F, et al. Multipotent mesenchymal stem cells from human subacromial bursa: potential for cell based tendon tissue engineering[J]. Tissue Eng: Part A,2014，20(1-2):239-249.

[3] Koo HH, Ahn HS. Umbilical cord blood transplantation[J]. Korean J Pediatr,2012, 55(7):219-223.

[4] Sokolova IB, Pavlichenko NN. Possible ways of MSCs influence on the ischemic tissue in the case of cardivascular diseases[J]. Tsitologiia,2010,52(11):911-917.

[5] De Miguel MP, Fuentes-Julián S, Blázquez-Martínez A, et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: advances and applications[J]. Curr Mol Med,2012，12(5):574-591.

[6] Lund TC, Boitano AE, Delaney CS, et al. Advances in umbilical cord blood manipulation-from niche to bedside[J]. Nat Rev Clin Oncol,2015，12(3):163-174.

[7] Dodd M, Marquez-Curtis L, Janowska-Wieczorek A, et al. Sustained expression of coagulation factor IX by modified cord blood-derived mesenchymal stromal cells[J]. J Gene Med,2014，16(5-6):131-142.

[8] Cao FJ, Feng SQ. Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury[J]. Chin Med J (Engl),2009,122(2):225-231.

[9] Bosch J, Houben AP, Radke TF, et al. Distinct differentiation potential of "MSC" derived from cord blood and umbilical cord: are cord-derived cells true mesenchymal stromal cells [J]. Stem Cells Dev,2012,20,21(11):1977-1988.

[10]張炳強(qiáng)，于麗，石娟,等. 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化[J]. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009,18(2):123-127

[11]Raza A, Ravandi F, Rastogi A, et al. A prospective multicenter study of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure[J]. Cytometry B Clin Cytom,2014,86(3):175-182.

[12]Krampera M, Glennie S, Dyson J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide[J],Blood,2003,101(9):3722-3729.

[13]Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K, et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells[J]. Exp Hematol,2003,31(10) :890-896.

[14]Giuliani M, Oudrhiri N, Noman ZM, et al. Human mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells down-regulate NK-cell cytolytic machinery[J]. Blood,2011,118(12): 3254-3262.

[15]Kimbrel EA, Kouris NA, Yavanian G, et al. Mesenchymal stem cell population derived from human pluripotent stem cells displays potent immunomodulatory and therapeutic properties[J]. Stem Cells Dev, 2014, 23(14): 1611-1624.

[16]Tan Z, Su ZY, Wu RR, et al. Immunomodulative effects of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells in vivo and in vitro[J]. J Zhejiang Univ Sci B,2011,12(1): 18-27.

[17]English K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation[J]. Immunol Cell Biol,2013,91(1):19-26.

[18]Dave S. Mesenchymal stem cells derived in vitro transdifferentiated insulin-producing cells: a new approach to treat type 1 diabetes[J]. Adv Biomed Res, 2014,3:266.

[19]Wada N, Bartold PM, Gronthos S. Human foreskin fibroblasts exert immunomodulatory properties by a different mechanism to bone marrow stromal/stem cells[J]. Stem Cells Dev,2011,20(4):647-659.

[20]Camp DM, Loeffler DA, Farrah DM, et al. Cellular immune response to intrastriatally implanted allogeneic bone marrow stromal cells in a rat model of Parkinson′s disease[J]. J Neuroinflamm,2009,6:17.

[21]Hu J, Zhang X, Zhou L, et al. Immunomodulatory properties of colonic mesenchymal stem cells[J]. Immunol Lett,2013,156(1-2):23-29.

[22]Zhang X, Tang T, Shi Q, et al. The immunologic properties of undifferentiated and osteogenic differentiated mouse mesenchymal stem cells and its potential application in bone regeneration[J]. Immunobiology,2009,214(3):179-186.

[23]Hall SR, Tsoyi K, Ith B, et al. Mesenchymal stromal cells improve survival during sepsis in the absence of heme oxygenase-1: the importance of neutrophils[J]. Stem Cells,2013,31(2):397-407.

[24]Chou SH,Lin SZ,Day CH, et al. Mesenchymal stem cell insights: prospects in hematological transplantation[J]. Cell Transplant,2013,22(4):711-721.

(2015-03-24修稿 2015-06-20修回)

安徽省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：KJ2009A118)

230022 合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部呼吸內(nèi)科

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.08.001