王　振，張　斌，王養(yǎng)民

精原干細(xì)胞的研究進(jìn)展

王振，張斌，王養(yǎng)民

[摘要]在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，干細(xì)胞已成為目前研究的熱點(diǎn)，并從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究向臨床應(yīng)用方面快速轉(zhuǎn)化。干細(xì)胞根據(jù)其特性一般可分為成體干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，而應(yīng)用于臨床的成體干細(xì)胞在治療多種疾病時(shí)表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢(shì)。精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells， SSCs)是精子形成的前體細(xì)胞，具有自我增殖和多向分化的潛能，是雄性動(dòng)物中唯一能將遺傳信息傳遞給后代的成體干細(xì)胞。SSCs培養(yǎng)與移植技術(shù)的發(fā)展不僅給男性不育患者帶來(lái)了希望,同時(shí)也為整個(gè)人類(lèi)生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]成體干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；誘導(dǎo)；不育,男(雄)性

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.09.021

不育是目前威脅人類(lèi)健康發(fā)展的重要因素，且隨著職業(yè)、環(huán)境和生活方式等因素的影響，男性不育的發(fā)病率不斷增加[1-3]，而單純的藥物治療或輔助生殖技術(shù)對(duì)于內(nèi)源性生殖細(xì)胞缺如所致的無(wú)精癥和精子畸形綜合征患者來(lái)說(shuō)無(wú)法達(dá)到生育目的。精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells， SSCs)具有自我更新的能力，可在正常成年男性生命期間通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂不斷增殖并分化形成精子[4]。因此，通過(guò)SSCs培養(yǎng)并誘導(dǎo)精子形成將給男性不育患者帶來(lái)希望。本文對(duì)SSCs的演變、微環(huán)境、鑒定、培養(yǎng)以及在治療男性不育等方面的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述如下。

1SSCs的演變

SSCs主要生長(zhǎng)于雄性動(dòng)物睪丸生精小管基底膜區(qū)域并維持其正常生殖能力的生殖干細(xì)胞，由早期胚胎的原始生殖細(xì)胞逐漸發(fā)育而來(lái)。原始生殖細(xì)胞來(lái)源于外胚層細(xì)胞，從卵黃囊基部被整合到正在形成的后腸中，沿后腸主動(dòng)遷移，并在遷移途中分裂增殖，最終形成前體細(xì)胞。對(duì)于雄性動(dòng)物而言，出生后前體細(xì)胞分化形成未分化型精原細(xì)胞和分化型精原細(xì)胞，前者認(rèn)為具有干細(xì)胞活性,最終分化為精子。另外，在正常生精上皮中，SSCs的自我更新和分化的比率基本上為1︰1。根據(jù)SSCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，可將小鼠A型精原細(xì)胞分為As型、Apr型和Aa1型，僅As型精原細(xì)胞具有干細(xì)胞活性。Apr型精原細(xì)胞進(jìn)一步分裂形成Aa1型精原細(xì)胞，后者再分裂形成A1型精原細(xì)胞，As/Apr/Aa1型精原細(xì)胞多分布在微環(huán)境中，當(dāng)它們分化成為A1型精原細(xì)胞時(shí)將會(huì)遷出此區(qū)域[5]。A1型精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)6次分裂形成A2型精原細(xì)胞，后者最終分化成為B型精原細(xì)胞[6]。在分化過(guò)程中，SSCs需經(jīng)歷As型向Apr型精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，Aa1型向A1型精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)變以及A1型向B型精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化的3個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)[7]。B型精原細(xì)胞最終分化形成精子細(xì)胞，進(jìn)而形成精子，當(dāng)與卵子結(jié)合形成受精卵后可將遺傳信息傳遞給下一代。因此，SSCs承載著傳遞物種遺傳信息的重大責(zé)任。

2SSCs的微環(huán)境

SSCs所存在的曲細(xì)精管區(qū)域在男性的一生中起到支持SSCs增殖和自我更新的作用。曲細(xì)精管及其周?chē)拈g質(zhì)組織由各種不同的細(xì)胞組成，為精子生成提供各種激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)微環(huán)境中SSCs的自我更新和增殖。由于SSCs的自我更新和分化既受到微環(huán)境的刺激，又受到膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、Plzf和c-kit等許多基因的精確調(diào)控，SSCs在離開(kāi)微環(huán)境后會(huì)發(fā)生分化[8]。另外，在SSCs的微環(huán)境中，活性氧是第二信使，SSCs從增殖到生長(zhǎng)抑制，再到衰老甚至死亡，均受到活性氧的干預(yù)[9-10]。維生素C可以調(diào)節(jié)活性氧的含量，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的損壞，促進(jìn)SSCs的增殖[11-12]。在微環(huán)境中，支持細(xì)胞僅占睪丸組織細(xì)胞總數(shù)的3%，是唯一直接與SSCs接觸和作用的體細(xì)胞，是SSCs微環(huán)境的重要組成細(xì)胞。另外，干細(xì)胞增殖與分化的平衡受到微環(huán)境的調(diào)控，微環(huán)境中促進(jìn)和誘導(dǎo)SSCs更新與分化的因子主要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、GDNF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)、集落刺激因子1(CSF1)、鋅指蛋白(PLZF)以及Ets家族轉(zhuǎn)錄因子等。因此，微環(huán)境是體外構(gòu)建SSCs培養(yǎng)體系的重要參考依據(jù)。

3SSCs的鑒定

鑒定SSCs的方法主要包括功能性鑒定和特異性標(biāo)志物鑒定。目前，SSCs的鑒定主要是功能性鑒定，方法是將分離后細(xì)胞再植入到動(dòng)物睪丸的生精小管中，通過(guò)其增殖分化的情況判斷所分離的細(xì)胞中是否含有SSCs。1994年，異種及異體移植小鼠SSCs實(shí)驗(yàn)表明SSCs不但可以在合適的體外培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期存活，而且可以通過(guò)移植SSCs的手段使原來(lái)不育的小鼠重新獲得產(chǎn)生精子細(xì)胞的能力。隨后，又有其他哺乳動(dòng)物SSCs的移植實(shí)驗(yàn)報(bào)道，Honaramooz等[13]行山羊SSCs移植實(shí)驗(yàn)，雖未產(chǎn)下后代，但產(chǎn)生了攜帶陽(yáng)性基因的精子，受精后有陽(yáng)性胚胎形成。生物特異性標(biāo)志物分離與鑒定是最準(zhǔn)確可靠的鑒定SSCs的方法。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞所表達(dá)的標(biāo)志物常包括GFRa1，POU3F1，POU5F1(OCT4)，ZBTB16(PLZF)，NGN3，NANOS2，NANOS3，SOHLH1，SOHLH2，F(xiàn)OXO1，ITGA6(α6-integrin，CD49f)，LIN28，ID4，UTF1，CDH1，GPR125，ITGB1(b1-integrin，CD29)，EPCAM(CD326)，CD9和THY1(CD90)[14]。現(xiàn)已證實(shí)人類(lèi)SSCs可以表達(dá)UTF1,Oct4，SALL4,ZBTB16,GFRa1,UCHL1,GPR125,LIN28,EXOSC10,FGFR3,DSG2,CBL,SSX2，Thy-1，c-kit和OCT2等多種表面標(biāo)志物。另外，F(xiàn)oxo1也是SSCs的表面標(biāo)志物，其免疫染色可作為未分化精子的一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)[14]，且具有較好的鑒定效果，對(duì)于SSCs穩(wěn)定性的維持和啟動(dòng)精子的產(chǎn)生具有重要意義。盡管以上標(biāo)志物均可用來(lái)鑒定SSCs，但鑒定SSCs的特異性表面標(biāo)志物仍然缺乏[15]。目前，應(yīng)用流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選技術(shù)可分離和純化小鼠的SSCs[16]。其中，早期胚胎細(xì)胞所表達(dá)的相同型SSCs的表面標(biāo)志物SALL4，常被用于流式細(xì)胞儀細(xì)胞分析[17]。另外，在磁珠分選分析時(shí)，ITGA6+和THY1dim常被用于從含有不同細(xì)胞成分的睪丸組織細(xì)胞懸液中高效地分離和純化人類(lèi)SSCs。近年來(lái)，通過(guò)研究多種表面標(biāo)志物(如β1整合蛋白、α6整合蛋白、Oct4,和VASA)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)[11,18-20]，β1整合蛋白和α6整合蛋白不僅表達(dá)于SSCs，也表達(dá)于其他體細(xì)胞和睪丸組織細(xì)胞，無(wú)法作為鑒定SSCs的特異性表面標(biāo)志物。只有Oct4和VASA在一些體細(xì)胞和睪丸組織細(xì)胞中不表達(dá)[20]。目前，Oct4、Thy-1、GFRa-1和c-kit常作為鑒定SSCs的表面標(biāo)志物，但金標(biāo)準(zhǔn)依然是SSCs的功能性鑒定。

4SSCs的分離

SSCs原代分離是體外研究的基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)SSCs的分離、純化主要集中在小鼠，經(jīng)純化后其純度可達(dá)68.8%[21]。對(duì)于人類(lèi)SSCs而言，由于其在睪丸組織中含量甚少，僅占生殖細(xì)胞的1/10 000,且細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物缺乏，給人類(lèi)SSCs的分離和純化帶來(lái)了很大困難。因此，如何提高人類(lèi)SSCs的分離效率是SSCs研究的關(guān)鍵之一。目前，分離SSCs常用差異貼壁法、離心法和流式細(xì)胞儀分選法。差異貼壁法根據(jù)SSCs與體細(xì)胞及睪丸組織內(nèi)的支持細(xì)胞是否貼壁而進(jìn)行分離，支持細(xì)胞和體細(xì)胞較SSCs易于貼壁，且在4～6 h內(nèi)可完成貼壁，研究認(rèn)為細(xì)胞在初次培養(yǎng)4 h后收集的SSCs純度最高[22]，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間是一個(gè)重要的影響因素；離心法是根據(jù)各細(xì)胞間不同的比重而設(shè)計(jì)的；流式細(xì)胞儀分選法是采用SSCs的表面標(biāo)志物免疫熒光技術(shù)分選陽(yáng)性細(xì)胞。以上方法均已應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)，且2010年由He等采用差異貼壁法分離出了人的精原細(xì)胞。

5SSCs的培養(yǎng)

國(guó)內(nèi)外對(duì)于SSCs的培養(yǎng)尚缺乏完善的培養(yǎng)體系[23]，且其培養(yǎng)方法復(fù)雜，培養(yǎng)成分不明確。目前，對(duì)于普通培養(yǎng)，研究者多采用以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，以無(wú)血清或少量血清(含1%血清)的DMED/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再加入多種營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，飼養(yǎng)層細(xì)胞可為干細(xì)胞提供多種必要的細(xì)胞因子和遞質(zhì)，他們與干細(xì)胞之間的相互作用是干細(xì)胞體外生存的重要條件。目前認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的GDNF是SSCs自我增殖和存活的重要因子[24-25]，只要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加GDNF和bFGF即可促進(jìn)小鼠SSCs增殖形成克隆,GFRA1并不是必需的生長(zhǎng)因子,但添加GFRA1能進(jìn)一步加快SSCs的增殖[26]。培養(yǎng)溫度、活性氧等也是影響SSCs產(chǎn)生的因素。另外，枸杞多糖對(duì)SSCs的體外增殖有促進(jìn)作用，聯(lián)合加入膠質(zhì)細(xì)胞源性GDNF與白血病抑制因子可使SSCs的增殖作用更加明顯[27]。對(duì)于較少接種數(shù)目SSCs的培養(yǎng)，微滴培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)了大鼠SSCs的增殖，尤其是接種數(shù)目少于5個(gè)細(xì)胞的微滴培養(yǎng)同樣可以實(shí)現(xiàn)大鼠SSCs的擴(kuò)增，這將為SSCs的進(jìn)一步研究提供新的技術(shù)支撐[28]。

近年來(lái)，為了簡(jiǎn)化培養(yǎng)方法，明確培養(yǎng)成分，研究者一直在嘗試著構(gòu)建一種完善的SSCs培養(yǎng)體系。有報(bào)道發(fā)現(xiàn),血清對(duì)SSCs的長(zhǎng)期培養(yǎng)造成負(fù)面影響,導(dǎo)致其分化[29-30]。因此，培養(yǎng)液血清濃度從1998年的10%降至2002年的1%，2008年培養(yǎng)液已轉(zhuǎn)變?yōu)榧葻o(wú)血清又無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞。然而，已有研究報(bào)道血清可以促進(jìn)SSCs的生成，且在含有低濃度血清的培養(yǎng)基中SSCs的生成狀況優(yōu)于無(wú)血清培養(yǎng)。因此，血清對(duì)于SSCs的培養(yǎng)所產(chǎn)生的利與弊，需要在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。

最近研究顯示，在SSCs分離后的兩代以?xún)?nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于細(xì)胞懸液中體細(xì)胞和睪丸組織細(xì)胞的存在，SSCs的增值狀態(tài)不穩(wěn)定，再加上SSCs在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。因此，SSCs的初期培養(yǎng)需及時(shí)純化。目前，在將SSCs接種到飼養(yǎng)層前，常采用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞懸液，促進(jìn)體細(xì)胞及其他細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，應(yīng)用差異貼壁法可促進(jìn)SSCs的純化，但更換培養(yǎng)皿的時(shí)間是關(guān)鍵。另外，在SSCs的傳代過(guò)程中，多采用低速離心(1000 r/min，3 min)甚至不離心，避免離心對(duì)細(xì)胞造成的損傷。研究顯示，低速離心對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷很小，且離心后吹開(kāi)再傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于不離心的細(xì)胞。

6SSCs的應(yīng)用前景

SSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生精子是治療男性不育的一個(gè)重要途徑。目前，所有可能導(dǎo)致男性不育的原因中，70%～90%是源于精子生成障礙。精原細(xì)胞在正常的睪丸生精細(xì)胞中所占比率很小，不到生精細(xì)胞總數(shù)的4%，而SSCs就更少，僅占0.02%～0.03%[30]。但在無(wú)精癥和少精癥患者的睪丸細(xì)胞中，SSCs濃度通常較正常人高。當(dāng)男性出現(xiàn)不育但仍有少量精子生成或處于單倍體時(shí)期的生殖細(xì)胞時(shí),可以采用體外受精、胞質(zhì)內(nèi)精子注射和胚胎移植等輔助生殖技術(shù)進(jìn)行治療。而對(duì)于幾乎無(wú)生精細(xì)胞或僅有二倍體細(xì)胞存在而導(dǎo)致的精子缺如是無(wú)法采用輔助生殖技術(shù)進(jìn)行治療的。

SSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生精子為非梗阻性無(wú)精癥患者的治療提供了新途徑[31]，一般包括體內(nèi)誘導(dǎo)和體外誘導(dǎo)。SSCs的移植是體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生精子的方法，即將外源性SSCs移植到受體睪丸生精小管中，使其誘導(dǎo)產(chǎn)生精子。對(duì)于需要接受放化療的患者,自體SSCs移植具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其不育多是放化療本身破壞機(jī)體正常的內(nèi)源性精子產(chǎn)生所導(dǎo)致的。因此，患者在接受放化療前將SSCs取出并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)治療后睪丸微環(huán)境恢復(fù)時(shí)再將培養(yǎng)好的SSCs移植回患者體內(nèi)，但SSCs的自體移植有腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。通過(guò)干細(xì)胞分選技術(shù)，在移植前將腫瘤細(xì)胞從SSCs懸液中清除出去，可有效避免這種風(fēng)險(xiǎn)[32]。SSCs體外誘導(dǎo)產(chǎn)生精子是科學(xué)家的“夢(mèng)想”。研究初期，由于SSCs分離困難，數(shù)量極少，阻礙了體外誘導(dǎo)精子的產(chǎn)生。目前，國(guó)內(nèi)外SSCs培養(yǎng)體系進(jìn)步明顯，可以培養(yǎng)出大量的SSCs，促進(jìn)了體外誘導(dǎo)精子產(chǎn)生的研究。2001年，Lee等在體外誘導(dǎo)出了新生牛的精子細(xì)胞。2012年，Minaee等將小鼠SSCs通過(guò)體外誘導(dǎo)，檢測(cè)出了減數(shù)分裂基因的表達(dá)。

除了SSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生精子，其他干細(xì)胞向生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)開(kāi)始，且已取得了一定成果。據(jù)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞是脂肪、滑膜、胰腺、外周血、羊水、臍血、胎盤(pán)等組織的來(lái)源[33]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是位于人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，具有取材方便、來(lái)源廣泛、數(shù)量充足、增殖能力強(qiáng)、長(zhǎng)期傳代遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[34]，通過(guò)誘導(dǎo)，可以分化為骨、軟骨、骨骼肌、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞，可為臨床工作提供來(lái)源穩(wěn)定的組織細(xì)胞[35]。因此，有研究將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能發(fā)生精原細(xì)胞樣的形態(tài)變化及伴發(fā)細(xì)胞的分化過(guò)程，而且能表達(dá)精原細(xì)胞的特征性標(biāo)記，提示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有向精原細(xì)胞方向分化的潛能；另外，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植于不育小鼠睪丸組織細(xì)胞中，移植后的間充質(zhì)干細(xì)胞能長(zhǎng)期存活并發(fā)生移行，且能促進(jìn)不育小鼠生殖功能的恢復(fù)[36]。

干細(xì)胞在不育方面的研究引起我們以下思考：①目前認(rèn)為干細(xì)胞主要用于治療非梗阻性無(wú)精癥的患者[37]，其適應(yīng)證還有哪些；②干細(xì)胞因子的激動(dòng)作用和如何準(zhǔn)確地進(jìn)行干細(xì)胞誘導(dǎo)定向分化，目前還有待進(jìn)一步解決[38]。因此，將干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)用于治療男性不育方面的研究剛剛起步，其研究目前僅停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的水平上，且由于倫理學(xué)以及技術(shù)手段的限制，應(yīng)用于臨床尚需一段時(shí)間，但隨著技術(shù)手段的發(fā)展和相關(guān)科技領(lǐng)域的進(jìn)步，干細(xì)胞的臨床治療必將會(huì)給人類(lèi)的健康帶來(lái)巨大的醫(yī)療價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1]邱實(shí),田洪陽(yáng).基層部隊(duì)精索靜脈曲張發(fā)病情況分析[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2013,25(1):86-88.

[2]宋旭東,唐文君.男性不育與生精細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)綜合臨床,2006,22(8):733-735.

[3]徐麗,周運(yùn)恒,李戩,等.男性不育患者解脲脲原體感染與精子質(zhì)量和抗精子抗體的關(guān)系[J].武警醫(yī)學(xué),2013,24(8):686-690.

[4]Harman J G, Richburg J H. Cisplatin-induced alterations in the functional spermatogonial stem cell pool and niche in C57/BL/6J mice following a clinically relevant multi-cycle exposure[J].Toxicol Lett, 2014,227(2):99-112.

[5]Yoshida S, Sukeno M, Nabeshima Y. A vasculature-associated niche for undifferentiated spermatogonia in the mouse testis[J].Science, 2007,317(5845):1722-1726.

[6]de Rooij D G, Russell L D. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask[J].J Androl, 2000,21(6):776-798.

[7]孫大林,張新東.精原干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)因子的研究進(jìn)展[J].中華男科學(xué)雜志,2011,17(3):268-272.

[8]Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Takashima S,etal. Reconstitution of mouse spermatogonial stem cell niches in culture[J].Cell Stem Cell, 2012,11(4):567-578.

[9]Terada L S. Specificity in reactive oxidant signaling: think globally, act locally[J].J Cell Biol, 2006,174(5):615-623.

[10]Menon S G, Goswami P C. A redox cycle within the cell cycle: ring in the old with the new[J].Oncogene, 2007,26(8):1101-1109.

[11]Hu J, Cheng D, Gao X,etal. Vitamin C enhances the in vitro development of porcine pre-implantation embryos by reducing oxidative stress[J].Reprod Domest Anim, 2012,47(6):873-879.

[12]Esteban M A, Wang T, Qin B,etal. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell, 2010,6(1):71-79.

[13]Honaramooz A, Behboodi E, Blash S,etal. Germ cell transplantation in goats[J].Mol Reprod Dev, 2003,64(4):422-428.

[14]Goertz M J, Wu Z, Gallardo T D,etal. Foxo1 is required in mouse spermatogonial stem cells for their maintenance and the initiation of spermatogenesis[J].J Clin Invest, 2011,121(9):3456-3466.

[15]Wang J, Cao H, Xue X,etal. Effect of vitamin C on growth of caprine spermatogonial stem cells in vitro[J].Theriogenology, 2014,81(4):545-555.

[16]Valli H, Sukhwani M, Dovey S L,etal. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells[J].Fertil Steril, 2014,102(2):566-580.

[17]Hobbs R M, Fagoonee S, Papa A,etal. Functional antagonism between Sall4 and Plzf defines germline progenitors[J].Cell Stem Cell, 2012,10(3):284-298.

[18]Bahadorani M, Hosseini S M, Abedi P,etal. Short-term in-vitro culture of goat enriched spermatogonial stem cells using different serum concentrations[J].J Assist Reprod Genet, 2012,29(1):39-46.

[19]Zhu H, Liu C, Sun J,etal. Effect of GSK-3 inhibitor on the proliferation of multipotent male germ line stem cells (mGSCs) derived from goat testis[J].Theriogenology, 2012,77(9):1939-1950.

[20]Eildermann K, Gromoll J, Behr R. Misleading and reliable markers to differentiate between primate testis-derived multipotent stromal cells and spermatogonia in culture[J].Hum Reprod, 2012,27(6):1754-1767.

[21]張學(xué)明,賴(lài)良學(xué),李德雪,等.小鼠精原細(xì)胞的分離和純化[J].解剖學(xué)報(bào),2000,31(3):235-238.

[22]張衛(wèi)星,韓廣業(yè),王瑞,等.大鼠精原干細(xì)胞的分離純化[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,44(3):497-500.

[23]Kanatsu-Shinohara M, Shinohara T. Spermatogonial stem cell self-renewal and development[J].Annu Rev Cell Dev Biol, 2013,29:163-187.

[24]Oatley J M, Avarbock M R, Telaranta A I,etal. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(25):9524-9529.

[25]Ryu B Y, Kubota H, Avarbock M R,etal. Conservation of spermatogonial stem cell self-renewal signaling between mouse and rat[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2005,102(40):14302-14307.

[26]申復(fù)進(jìn),張茨,楊嗣星,等.BALB/c小鼠精原干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和鑒定[J].中華男科學(xué)雜志,2008,14(11):977-981.

[27]馬良宏,邱志軍,閆圣男,等.枸杞多糖對(duì)精原干細(xì)胞體外增殖的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(23):4277-4281.

[28]霍龍,羅奮華,張巖,等.大鼠精原干細(xì)胞的微滴培養(yǎng)法[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2014,5:671-678.

[29]Olive V, Cuzin F. The spermatogonial stem cell: from basic knowledge to transgenic technology[J].Int J Biochem Cell Biol, 2005,37(2):246-250.

[30]Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K,etal. Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions[J].Biol Reprod, 2005,72(4):985-991.

[31]Kubota H, Avarbock M R, Brinster R L. Culture conditions and single growth factors affect fate determination of mouse spermatogonial stem cells[J].Biol Reprod, 2004,71(3):722-731.

[32]Koruji M, Shahverdi A, Janan A,etal. Proliferation of small number of human spermatogonial stem cells obtained from azoospermic patients[J].J Assist Reprod Genet, 2012,29(9):957-967.

[33]Fujita K, Ohta H, Tsujimura A,etal. Transplantation of spermatogonial stem cells isolated from leukemic mice restores fertility without inducing leukemia[J].J Clin Invest, 2005,115(7):1855-1861.

[34]王曉輝,惠玲,楊霄鵬,等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定及其誘導(dǎo)分化的研究[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2013,25(10):11-15,30.

[35]崔爽,楊東明.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性腎缺血再灌注損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床軍醫(yī)雜志,2013,(2):211-212.

[36]楊雯,惠玲,呂同德,等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向分化及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2013,25(10):26-30.

[37]劉芳,陳必良,蘇明權(quán),等.DAZ基因在無(wú)、少精癥患者血液、精液中的缺失研究[J].武警醫(yī)學(xué),2004,15(4):515-518.

[38]唐秋靈.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向男性生殖細(xì)胞分化的研究[C].汕頭大學(xué),2008.

(收稿時(shí)間：2015-05-10修回時(shí)間：2015-07-05)

Research Progression of Spermatogonial Stem Cells

WANG Zhen1, ZHANG Bin2, WANG Yang-min2

(1. Department of Urinary Surgery, the Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730030, China; 2. Department of Urinary Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]The stem cells has become the study focus in biomedical field at present， and the study trend has quickly extended from preclinical medicine to clinical application. Stem cells can be classified with somatic stem, pluripotent stem and embryonic stem cells according to its characteristics. Somatic stem cells have obviously advantage in treatment of many diseases in clinic. The spermatogonial stem cells (SSCs) are precursor cells of spermatogenesis, and they have the potentialities of the self duplication and multi-directional differentiation, and are the only somatic stem cells that can pass the genetic information to offspring in male animals. Development of culture and transplantation technology in the SSCs study can not only help the therapy of male infertility patients, but also provide a scientific basis to the development of whole human reproductive medicine.

[Key words]Adult stem cells; Cell culture techniques; Induction; Infertility, male

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書(shū)資料分類(lèi)號(hào)]R329.24A

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)09-0100-05

[通訊作者]王養(yǎng)民，E-mail：13919931420@163.com

[基金項(xiàng)目]全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(CLZ11JB09)；蘭州軍區(qū)攻關(guān)課題(LZ13GY01)
[作者單位]730030 蘭州，蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科(王振)；730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院泌尿外科(張斌、王養(yǎng)民)