洪煒龍， 陸 紅， 吳存造， 林成成， 梁 勇， 王斯璐， 陳必成， 白永恒△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1外科實(shí)驗(yàn)室， 2醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心， 3移植科，浙江 溫州 325000)

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環(huán)杷明對馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及Hedgehog通路的影響*

洪煒龍1， 陸 紅2， 吳存造3， 林成成1， 梁 勇1， 王斯璐1， 陳必成1， 白永恒1△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1外科實(shí)驗(yàn)室，2醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，3移植科，浙江 溫州 325000)

目的： 探討環(huán)杷明干預(yù)Hedgehog(HH)信號對馬兜鈴酸(AA)致腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)累積的影響。方法: 根據(jù)干預(yù)措施將體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E分為溶劑對照組、AA損傷組(分別用終濃度為1、5和10 mg/L的AA處理細(xì)胞)和環(huán)杷明干預(yù)組(10 mg/L AA基礎(chǔ)上加入1、5和10 μmol/L環(huán)杷明)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用real-time PCR檢測HH信號關(guān)鍵分子Ptch1和Smo、表型轉(zhuǎn)化相關(guān)分子α-SMA和E-cadherin、ZO-1、BMP-7和基質(zhì)成分I型和III型膠原mRNA的表達(dá)；ELISA法檢測Shh和TGF-β1的含量；細(xì)胞免疫熒光染色檢測Ptch1、Smo、E-cadherin、α-SMA和III型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果: AA不僅增加了TGF-β1、α-SMA和III型膠原的表達(dá)，降低了E-cadherin和ZO-1的表達(dá)，而且誘導(dǎo)了Shh和Smo mRNA表達(dá)的升高和Ptch1 mRNA表達(dá)的下降，提示AA促進(jìn)小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和膠原累積，同時(shí)也激活了HH信號通路。環(huán)杷明干預(yù)AA作用后，Smo mRNA或蛋白表達(dá)下調(diào)，Ptch1 mRNA表達(dá)升高，這說明環(huán)杷明抑制了AA誘導(dǎo)的HH信號通路的活化。此外，環(huán)杷明也降低TGF-β1、α-SMA、I型和III型膠原的表達(dá)，提高BMP-7、ZO-1和E-cadherin的表達(dá)，這提示環(huán)杷明抑制了AA所致的上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)累積。結(jié)論: 環(huán)杷明可抑制AA所致的腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)累積，可能是通過靶向抑制HH信號的活化來實(shí)現(xiàn)的。

環(huán)杷明； 馬兜鈴酸； 表型轉(zhuǎn)化； 基質(zhì)累積； Hedgehog信號

前期研究顯示，馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)和釋放TGF-β1，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，最終導(dǎo)致基質(zhì)成分I和III型膠原的過度累積[1]。在此過程中，損傷的上皮細(xì)胞反饋性誘導(dǎo)與增殖相關(guān)信號的活化，引起細(xì)胞異常增殖可能是EMT和基質(zhì)累積的關(guān)鍵因素。我們前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了AA所致EMT及基質(zhì)累積過程中Hedgehog(HH)信號被激活[2]。然而，HH信號活化是否為AA所致的腎間質(zhì)纖維化所必須，且AA損傷腎小管過程中，干預(yù)HH信號能否降低基質(zhì)累積等均尚未明確。本研究擬通過環(huán)杷明(cyclopamine，Cyp)特異性阻斷HH信號活化，從體外實(shí)驗(yàn)角度觀察其對AA所致的EMT和基質(zhì)累積的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、試劑和儀器

大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E購于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

馬兜鈴酸(Sigma)；Cyp (Merck)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶和TRIzol提取液(Gibco)；兔抗鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA) 單克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗鼠上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(Abcam)；Shh和TGF-β1 ELISA檢測試劑盒(上海西唐生物)；real-time PCR試劑(Promega)。

MyCycler梯度PCR儀(Bio-Rad)；7500定量PCR儀(Applied Biosystems)；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀(Thermo Scientific)；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1 大鼠腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 NRK-52E細(xì)胞用5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)密度并鋪板于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度約為70%時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)立溶劑對照組：不加入AA和Cyp；AA損傷組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10 mg/L AA；Cyp干預(yù)組：在10 mg/L AA的基礎(chǔ)上，分別加入1、5和10 μmol/L的 Cyp。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.2 Real-time PCR檢測mRNA的表達(dá) 采用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，測定260/280 nm吸光度值以確定純度和濃度。根據(jù)試劑說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)、Ptch1、Smo、α-SMA、E-cadherin、ZO-1、I型膠原(collagen I)和III型膠原的mRNA設(shè)計(jì)特異性引物，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用real-time PCR相對定量法進(jìn)行檢測。引物由上海捷瑞公司合成，序列如表1所示。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行定量PCR，PCR擴(kuò)增體系：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、上下游引物各1 μL，終濃度為200 nmol/L、1 μL cDNA、2 μL反應(yīng)緩沖液。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s， 60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。通過熔解曲線評價(jià)PCR結(jié)果可靠性，采用2-ΔΔCt計(jì)算相對mRNA表達(dá)量。

2.3 ELISA檢測Shh和TGF-β1的含量 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)上清液。采用雙抗體夾心ELISA法檢測TGF-β1和Shh的含量，即預(yù)先分別將抗大鼠TGF-β1和Shh單抗包被于酶標(biāo)板，并特異性地與標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的TGF-β1和Shh結(jié)合，分別加入生物素化的抗大鼠TGF-β1和Shh，形成免疫復(fù)合物連接在酶標(biāo)板上，并利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素結(jié)合，與加入的底物工作液反應(yīng)顯藍(lán)色，最后加入硫酸終止顯色反應(yīng)，測量在450 nm處的吸光度值(A)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出Shh與TGF-β1濃度。

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測Ⅲ型膠原、α-SMA和E-cadherin蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期NRK-52E細(xì)胞，分為溶劑對照組、AA損傷組和AA基礎(chǔ)上分別加入1、5和10 μmol/L Cyp干預(yù)組并進(jìn)行爬片培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100破膜。0.5%正常山羊血清封閉。各爬片滴加針對α-SMA、E-cadherin和III型膠原的 I 抗工作液，4℃孵育過夜。用Dylight 488(綠色)或594(紅色)標(biāo)記的 II 抗工作液，37 ℃孵育60 min。滴加DAPI于蓋玻片上，室溫染色5 min。細(xì)胞胞質(zhì)綠色或紅色和胞核藍(lán)色為陽性著色。每組取10張片，每張取10個(gè)高倍視野(×400)，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光累積光密度(IA)值。

表1 擴(kuò)增HH信號通路、EMT和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)相關(guān)基因mRNA的特異性引物

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組樣本比較采用t檢驗(yàn)和精確概率法，多組樣本比較采用單因素方差分析，兩組樣本關(guān)聯(lián)性比較采用相關(guān)分析。以P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cyp對AA誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞基質(zhì)累積的影響

細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，10 mg/L的AA作用NRK-52E細(xì)胞后，可顯著上調(diào)III型膠原蛋白的表達(dá)。用Cyp干預(yù)后，III型膠原表達(dá)水平顯著下降，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，見圖1。Real-time PCR結(jié)果顯示，AA不僅增加了collagen Ⅲ mRNA的表達(dá)，同樣也提高了collagen Ⅰ mRNA的表達(dá)，見圖2。Cyp干預(yù)后，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA的表達(dá)水平均顯著下調(diào)。這些結(jié)果提示，Cyp能抑制AA所致的基質(zhì)累積效應(yīng)。

2 Cyp對AA誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，AA下調(diào)了E-cadherin和ZO-1 mRNA的表達(dá)水平，上調(diào)了α-SMA mRNA的表達(dá)水平，見圖2。細(xì)胞免疫熒光染色顯示，AA也下調(diào)了E-cadherin蛋白的表達(dá)，升高了α-SMA的表達(dá)，見圖3。應(yīng)用Cyp干預(yù)后，E-cadherin和ZO-1表達(dá)上調(diào)，而α-SMA的表達(dá)下降。此外，Cyp上調(diào)了表型轉(zhuǎn)化抑制因子BMP-7 mRNA的表達(dá)。這些結(jié)果顯示，Cyp可抑制AA所致的EMT進(jìn)程。

Figure 1.The expression of type III collagen in the NRK-52E cells induced by AA with or without Cyp treatment (×200). A: control; B: AA 1 mg/L; C: AA 10 mg/L; D: AA 10 mg/L+Cyp 1 μmol/L; E: AA 10 mg/L+Cyp 5 μmol/L; F: AA 10 mg/L+Cyp 10 μmol/L. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs A group ; #P<0.05, ##P<0.01 vs C group.

3 Cyp對AA誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的影響

本實(shí)驗(yàn)中，Cyp的干預(yù)可有效降低NRK-52E細(xì)胞分泌TGF-β1量，并且其抑制作用呈現(xiàn)Cyp濃度依賴性，見圖4。

4 Cyp對AA誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HH信號表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，Cyp作用NRK-52E細(xì)胞24 h后，隨著Cyp濃度增加，Ptch1 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，Smo 的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，提示HH信號通路被抑制，見圖5。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果也顯示Cyp逆轉(zhuǎn)了AA所致的Smo高表達(dá)和Ptch1低表達(dá),見圖6。然而，ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Cyp濃度增加，Shh分泌表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(圖7)，我們推測這可能與HH信號被阻斷后導(dǎo)致信號起始因子Shh的蓄積作用有關(guān)。

Figure 2.The mRNA expression of ECM and EMT related molecules in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ## P<0.01 vs AA 10 group.

Figure 3.The expression of E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells induced by AA with or without Cyp treatment (×200). A: control; B: AA 1 mg/L; C: AA 10 mg/L; D: AA 10 mg/L+Cyp 1 μmol/L; E: AA 10 mg/L+Cyp 5 μmol/L; F: AA 10 mg/L+Cyp 10 μmol/L. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs A group; #P<0.05 vs C group.

Figure 4.The contents of TGF-β1 in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L)determined by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs AA 10 group.

討 論

HH信號通路主要由配體 sonic hedgehog(Shh)、膜受體Patched(Ptch)、信號開關(guān)蛋白Smoothened(Smo)及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli組成[3]。正常表達(dá)的HH信號在器官發(fā)育和器官修復(fù)再生過程中起著重要作用[4]，但持續(xù)異常激活的HH信號可導(dǎo)致胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生[5]。

近來有研究報(bào)道，HH信號活化也參與了多種組織的纖維化[6-7]。在梗阻性膽管疾病中，HH可被活化，進(jìn)而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞EMT，最終導(dǎo)致膽管纖維化[6]。我們前期研究也顯示，輸尿管梗阻誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化過程中，可激活HH信號[7]。活化的HH信號可提高TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致基質(zhì)成分在腎間質(zhì)的過度累積。因此，可以從HH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上入手，查找信號調(diào)控的相關(guān)藥物，可發(fā)揮一定的抗纖維化作用。

最近研究顯示，環(huán)耙明可調(diào)控HH信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制肝纖維化[7]。Cyp是一種從藜蘆屬植物內(nèi)分離得到的異甾體類生物堿。Cyp可特異性改變Smo空間構(gòu)象，抑制其活性，從而抑制HH信號通路[8-9]。此外，Cyp與Smo結(jié)合能夠使細(xì)胞的分裂停止于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。然而，Cyp調(diào)控HH信號活化通過何種機(jī)制影響AA所致的纖維化進(jìn)程尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，AA可上調(diào)TGF-β1、Smo、α-SMA、I型和III型膠原的表達(dá)，下調(diào)BMP-7、E-cadherin、ZO-1和Patch1表達(dá)。TGF-β1是一種重要的促纖維化因子，其表達(dá)升高可誘導(dǎo)多種上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)累積，E-cadherin和ZO-1均為上皮細(xì)胞標(biāo)志物，而α-SMA為肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，E-cadherin和ZO-1表達(dá)的降低和α-SMA表達(dá)的增加提示AA誘導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Patch1表達(dá)的下調(diào)和Smo表達(dá)的上調(diào)則提示HH信號被活化。我們推測，在AA損傷微環(huán)境中，損傷嚴(yán)重的上皮細(xì)胞可能發(fā)生凋亡、壞死、崩解并釋放大量炎癥因子、趨化因子等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)周圍未受損或受損程度較輕的上皮細(xì)胞異常增殖。同時(shí)，與增殖相關(guān)的HH信號被活化?；罨腍H信號推動小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，而后者能分泌膠原成分在局部累積導(dǎo)致纖維化樣改變。應(yīng)用Cyp可抑制HH信號通路，下調(diào)肌成纖維細(xì)胞和纖維化相關(guān)分子的釋放和表達(dá)，進(jìn)而抑制膠原累積降低纖維化樣改變。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，HH通路被抑制情況下，Shh分泌表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，推測可能與HH信號被阻斷后導(dǎo)致信號起始因子Shh的蓄積作用有關(guān)。

Figure 5.The mRNA expression of Ptch1 and Smo in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AA 10 group.

Figure 6.The expression of Ptch1 and Smo in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment (×400). Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs AA 10 group.

Figure 7.Shh contents in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment determined by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs AA 10 group.

綜上所述，我們初步從體外實(shí)驗(yàn)角度揭示Cyp可通過靶向阻斷HH信號，下調(diào)了AA誘導(dǎo)的TGF-β1的表達(dá)和釋放，抑制EMT和膠原累積，最終緩解纖維化樣改變。然而，Cyp干預(yù)HH信號進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化作用尚需未來的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控途徑上查找有效的治療藥物，在一定程度上可為腎間質(zhì)纖維化的治療提供新的思路。

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Effect of cyclopamine on aristolochic acid-induced phenotypic transformation and Hedgehog pathway in renal epithelial cells

HONG Wei-long1, LU Hong2, WU Cun-zao3, LIN Cheng-cheng1, LIANG Yong1, WANG Si-lu1, CHEN Bi-cheng1, BAI Yong-heng1

(1SurgeryLaboratory,2DepartmentofLaboratoryMedicine,3DepartmentofTransplantation,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:greatsailor@163.com)

AIM: To investigate the effect of cyclopamine on Hedgehog (HH) signaling, phenotypic transformation and matrix accumulation induced by aristolochic acid (AA) in renal tubular epithelial cell NRK-52E. METHODS: NRK-52E cells were randomly divided into control group (treated with solvent only), AA group (treated with AA at concentrations of 1, 5, 10 mg/L) and cyclopamine group (treated with AA at concentration of 10 mg/L plus cyclopamine at concentrations of 1, 5, 10 μmol/L). After cultured for 24 h, the mRNA expression of Ptch1, Smo, α-SMA, E-cadherin, ZO-1, BMP-7, type I collagen and type III collagen was quantified by real-time PCR. The protein levels of Shh and TGF-β1 were detected by ELISA. Immunofluorescence staining was used to evaluate the expression of Ptch1, Smo, α-SMA, E-cadherin and type III collagen in the NRK-52E cells. RESULTS: AA increased the expression of TGF-β1, α-SMA and type III collagen, decreased the expression of E-cadherin and ZO-1 protein, and down-regulated the expression of Ptch1， Shh and Smo mRNA in the NRK-52E cells, indicating that AA activated HH signaling, and phenotypic transformation and matrix accumulation occurred in AA-treated NRK-52E cells. Treatment with cyclopamine inhibited HH signaling by decreasing Smo expression and increasing Ptch1 expression. Moreover, cyclopamine also down-regulated the expression of TGF-β1, α-SMA, type I collagen and III collagen, and up-regulated the expression of BMP-7, ZO-1 and E-cadherin. CONCLUSION: AA induces phenotypic transformation and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells, which can be inhibited by cyclopamine treatment. The possible mechanism is that cyclopamine suppresses the activation of HH signaling, resulting in the reduction of epithelial-to-mesenchymal transition and matrix deposition.

Cyclopamine; Aristolochic acid; Phenotype transformation; Matrix accumulation; Hedgehog signaling

1000- 4718(2015)01- 0069- 07

2014- 03- 27

2014- 12- 03

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LQ12H05001; No. LY12H05004)；溫州市科技局項(xiàng)目(No. Y20110028; No. Y20130149)

△通訊作者 Tel： 0577-55579220； E-mail：greatsailor@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.014