肖維華, 趙靈靈, 應麗麗, 馬海芬, 吳 亮, 陳國榮△

(1寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院病理科，浙江 寧波 315800； 2溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

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肺腺癌巨噬細胞M2表型邊緣極化效應觀察及預后分析*

肖維華1, 趙靈靈2, 應麗麗2, 馬海芬1, 吳 亮2, 陳國榮2△

(1寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院病理科，浙江 寧波 315800；2溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

目的： 探討肺腺癌邊緣區(qū)巨噬細胞M2表型的極化效應、邊緣/中心比值及對預后的影響。方法: 采用雙重免疫組化技術，觀察巨噬細胞CD163+/CD68+表型(M2表型)在49例原位肺腺癌(AIS)、11例微小浸潤性腺癌(MIA)、57例浸潤性腺癌(IA)邊緣區(qū)及中心區(qū)的分布規(guī)律和差異，探討巨噬細胞邊緣極化效應及邊緣/中心比值在肺腺癌進程中的作用及機制。采用單因素Kaplan-Meier 生存曲線分析及多變量Cox生存分析探討M2表型邊緣極化狀態(tài)與預后的關系。結果: 肺腺癌邊緣區(qū)M2型巨噬細胞較中心區(qū)域呈現極性聚集，具有顯著差異(P<0.01)。根據中位數分高、低極化組，低極化組AIS中M2型巨噬細胞計數值與MIA及IA比較未見明顯差別，但其在高、極化組AIS中的計數值依次低于MIA和IA，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。單因素Kaplan-Meier 生存曲線分析及l(fā)og-rank檢驗結果顯示邊緣區(qū)巨噬細胞M2表型數量及邊緣/中心比值與生存時間呈負相關(2=44.71，P<0.01；2=21.75，P<0.01)。多變量Cox生存分析表明M2表型邊緣高極化狀態(tài)和邊緣/中心比值是獨立的預后危險因素(P<0.01)。結論: 巨噬細胞M2表型在肺腺癌邊緣區(qū)存在邊緣極化效應，其邊緣極化狀態(tài)和邊緣/中心比值是獨立的預后危險因素，因此術前穿刺判斷邊緣極化狀態(tài)或術后活檢檢測M2型巨噬細胞型邊緣/中心比值可能是評估預后的一種有效方法。

肺腫瘤； 巨噬細胞； 極化； 預后

巨噬細胞是具有異質性的細胞群，具有多種功能，其在復雜的腫瘤微環(huán)境下可極向分化為替代激活的M2型巨噬細胞[1]。CD163可作為M2型巨噬細胞活化的重要標記[2]，與CD68共表達能更準確地識別該亞型細胞，后者激活狀態(tài)與肺腺癌[3]、胰腺癌[4]和卵巢癌[5]等多種腫瘤預后有關。以往研究側重的是M2型巨噬細胞在腫瘤實質中心區(qū)浸潤的臨床意義。本研究著重觀察其在人肺原位、微小浸潤性和浸潤性肺腺癌中不同解剖區(qū)域分布差別，評估邊緣區(qū)/中心區(qū)比值變化，同時分析這些參數對肺腺癌預后的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

回顧性研究117例溫州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科存檔肺腺癌根治標本，時間范圍為2002年3月至2008年10月。所有標本經4%中性甲醛固定，石蠟包埋。參考肺腺癌2011年新分類[6]進行診斷及分類。篩選合適的肺腺癌邊緣區(qū)存檔蠟塊及對應數量的癌中心蠟塊作為組織樣本，其中男性42例，女性75例，年齡25～76歲。肺腺癌樣本分3組，包括原位肺腺癌(adenocarcinomainsitu，AIS)49例、微小浸潤性腺癌(minimally invasive adenocarcinoma, MIA)11例和浸潤性腺癌(invasive adenocarcinoma, IA)57例。術后采用電話、信件及上門等方式進行隨訪，共3人失訪。隨訪截止日期為2011年4月，隨訪時間為8～125個月(平均53.60個月)。隨訪期內因肺癌死亡34例，生存期8～95個月(平均47.71個月)。

2 主要試劑

PBS(磷酸鹽緩沖液粉劑，0.01 mol/L，pH 7.2～7.4)、檸檬酸鹽抗原修復液(pH 6.0)和3%H2O2購自北京中杉金橋生物技術有限公司，主要抗體包括CD68(克隆號KP，鼠抗人單克隆，胰酶消化，MAB-0041)、HLA-DR(克隆號LN3，鼠抗人單克隆，無需修復，MAB-0093) 和CD163(克隆號10D6，鼠抗人單克隆，高溫修復，MAB-0206)，均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。試劑盒PV-6000(規(guī)格：通用型 Polymer Kit 18 mL×2)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，其組成包括內源性過氧化物酶阻斷劑，Ⅱ抗-HRP多聚體以及PV-6000 辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體。DouSPTM免疫組化雙染試劑盒(KIT-9999)。

3 主要方法

3.1 準備步驟 組織常規(guī)切片，厚度4 μm，放入65 ℃烘箱中烘烤45 min，脫蠟過程為二甲苯10 min×3次、100%乙醇×2次、95%乙醇×1次、80%乙醇×1次、75%乙醇×1次，每次5 min,蒸餾水沖洗5 min ×1次。

3.2 雙重免疫組化染色步驟 石蠟白片經脫蠟及水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3～5 min。根據Ⅰ抗的要求，對組織抗原進行相應的修復。每張切片加50 μL過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min，每張切片加50 μL正常非免疫動物血清，室溫下孵育后除去，加50 μL CD163抗體，室溫下孵育60 min。加50 μL生物素標記的Ⅱ抗，孵育完畢后加50 μL鏈霉菌抗生物素-堿性磷酸酶溶液，除去PBS液后加入100 μL BCIP/NBT顯色液，顯微鏡下觀察并控制顯色強度。加50 μL雙染增強液，室溫下孵育10 min。進行胰酶修復，加入50 μL正常非免疫動物血清。除去血清，加50 μL CD68抗體，室溫下孵育60 min。加50 μL生物素標記的Ⅱ抗，加50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，加100 μL新鮮配制的AEC溶液，室溫下顯色。自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍。直接用水性封片劑封片，顯微鏡下觀察結果。

3.3 細胞識別 利用雙重免疫組化染色技術識別巨噬細胞M2表型，CD163+/CD68+雙重陽性細胞為M2型巨噬細胞。雙重染色第1種抗體著色為棕褐色顆粒狀或呈藍黑色，第2種抗體著色為棕紅色顆粒狀。

3.4 形態(tài)學測量方法 使用NIKON相機(型號E4500)采用固定焦距(16 mm)光圈優(yōu)先(f=3.4),分別隨機拍攝肺腺癌邊緣區(qū)和中心區(qū)高倍鏡視野各5個，運用Image-Pro Plus軟件，分別計數M2型巨噬細胞在各區(qū)域的分布數量，以平均值作為最終數值。Microsoft Excel 2003軟件計算邊緣/中心比值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較采用方差分析。采用單因素Kaplan-Meier法和log-rank檢驗對預后加以分析，并采用多因素Cox風險比例模型篩選獨立預后危險因子。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 M2型巨噬細胞在肺腺癌邊緣區(qū)的分布特征

在117例手術切除的肺腺癌邊緣區(qū)中均可查見巨噬細胞。光鏡下可見棕褐色CD68陽性染色顆粒定位于巨噬細胞胞漿和胞膜，同時呈藍黑色(CD163陽性著色)及棕紅色(CD68陽性著色)雙重著色細胞被識別為M2型巨噬細胞。M2型巨噬細胞主要位于癌性腺腔及間質內，上皮內偶可見灶性浸潤。CD68陽性細胞數量明顯多于CD163+/CD68+細胞，腫瘤組117例樣本邊緣區(qū)巨噬細胞M2表型的中位數為23.40(cells/HPF), 最小值及最大值分別為1.20 和58.20(cells/HPF)。M2型巨噬細胞形態(tài)學變化較大，癌性腺腔內細胞體積較間質明顯增大，形態(tài)較為單一，多為圓形、卵圓形，變形細胞少見。相反，間質內細胞形態(tài)則多變，體積較小，大小不一，胞漿不規(guī)則，可見多個模糊的突起，部分核呈梭形。

2 M2型巨噬細胞在肺腺癌中邊緣區(qū)與中心區(qū)的極化差異及邊緣區(qū)/中心區(qū)比值的變化

117例肺腺癌樣本中，邊緣區(qū)M2型巨噬細胞數量高于中心區(qū)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其分布規(guī)律的直方圖見圖1。方差分析顯示肺腺癌邊緣區(qū)M2型巨噬細胞在3種肺腺癌類型之間比較時具有顯著差異(F=69.275，P<0.01)，同時顯示其在中心區(qū)的分布也是存在顯著差別的(F=16.445，P<0.01)。上述結果提示M2型巨噬細胞在邊緣區(qū)和中心區(qū)均存在差別極化現象AIS組M2表型數量均明顯低于MIA組和IA組P<0.01)，值得注意的是，MIA組和IA組間M2表型數量比較未見明顯差異(P>0.05)。對M2型巨噬細胞邊緣/中心區(qū)比值進行統(tǒng)計及評估，結果顯示AIS組邊緣/中心比值為1.21±0.42，MIA為0.98±0.65，IA為0.53±0.66，F=18.758，P<0.01。AIS組M2表型邊緣/中心比值與MIA組比較未見明顯差別(P>0.05),但明顯高于IA組(P<0.01)；MIA與IA間比較，對應的邊緣/中心比值變化也有顯著差異(P<0.05)，見表1。采用雙重免疫組化與形態(tài)學結合的方法，觀察到M2型巨噬細胞在不同類型肺腺癌中不同區(qū)域的變化，更直觀地反映了上述數值變化,見圖2。

Figure 1. The distribution of M2 macrophages in the marginal (A) and central (B) regions of lung adenocarcinoma.

表1 腫瘤組巨噬細胞M2表型邊緣區(qū)與中心區(qū)的分布差異

AC: lung adenocarcinoma; MR: marginal regions; CR: central regions; M/C ratio: MR/CR ratio．##P<0.01vsCR;*P<0.05,**P<0.01vsIA;△P<0.05,△△P<0.01vsMIA;▲▲P<0.01vsAIS.

Figure 2.Expression and distribution of M2 macrophages in the marginal region and central region (double staining by SP method, ×400).

3 單因素Kaplan-Meier 生存曲線分析及l(fā)og-rank檢驗

結果顯示,M2型巨噬細胞高極化組患者生存時間明顯短于低極化組(2=44.71，P<0.01)，M2型巨噬細胞浸潤的數量與生存時間呈負相關,見表2。低邊緣/中心比值組生存時間明顯長于高邊緣/中心比值組(2=21.75，P<0.01)，邊緣/中心比值與生存時間呈負相關,見圖3。

4 多變量Cox風險比例模型生存分析

采用Cox比例風險模型對邊緣區(qū)M2型巨噬細胞極化狀態(tài)、極化分組和邊緣/中心比值進行多變量生存分析，以確定巨噬細胞M2表型不同極化狀態(tài)、分組及邊緣/中心比值是否與患者的生存時間獨立相關。多因素生存分析結果顯示肺腺癌中M2巨噬細胞極化狀態(tài)及邊緣/中心比值是判斷患者預后的獨立因素(P<0.01)，但極化分組不是獨立預后指標(P>0.05),見表3。

表2 單因素Kaplan-Meier 生存曲線分析及l(fā)og-rank檢驗

3 cases were lost during follow-up.

討 論

肺腺癌具有異質性，除表現多種形態(tài)學變化外，其周邊癌組織浸潤的情況也是非常復雜多變。邊緣癌組織的分化程度、浸潤形式及免疫反應一定程度反映了癌組織的侵襲能力，對患者預后可能會產生一定影響。M2型巨噬細胞是一種近年來人們逐漸認識到的巨噬細胞功能表型之一 ，為非經典替代性活化的巨噬細胞表型[7]。研究證實M2型巨噬細胞能促進小鼠肺癌移植瘤生長、淋巴管生成和淋巴結轉移[8]。然而，目前還沒有人體研究探討M2型巨噬細胞在肺腺癌亞型中心區(qū)與邊緣區(qū)的差異和機制，也尚未證實2種區(qū)域比值是否對預后會產生一定影響。

本實驗通過雙重免疫組化方法對肺腺癌巨噬細胞M2表型進行標記，結果顯示M2型巨噬細胞計數顯著高于對照組，這提示肺腺癌存在巨噬細胞表型的極向分化，與肺腺癌的發(fā)生機制可能密切相關。然而,這個M2型極化巨噬細胞在肺腺癌生長和轉移過程的作用仍然是未知的。當然相關基礎研究或許能給我們提供一些參考。Li等[9]的研究觀察到肺癌A549細胞株與巨噬細胞共培養(yǎng)能誘導基質金屬蛋白酶、血管內皮生長因子和單核細胞趨化因子的表達，提升A549細胞的浸潤潛能。Mitsuhashi等[10]對肺表面活性物質相關蛋白A(surfactant protein-A，SP-A)基因轉導的人肺腺癌細胞株進行研究，認為SP-A可能參與了對巨噬細胞的極化，通過巨噬細胞招募和活化NK細胞，進而抑制肺癌的進展。對這些巨噬細胞基因在腫瘤中表達的調節(jié)至少部分是由于缺氧誘導的低氧誘導因子 1α(hypoxia-inducible fac-tor 1α，HIF-1α)和HIF-2α因子上調導致的[11]。有研究認為巨噬細胞主要參與癌癥相關的炎癥反應，后者能促進腫瘤細胞增生及血管生成,最終對疾病進展過程產生重要的影響[12]。

Figure 3.Effects of polarized aggregation of M2 macrophages in the marginal region of lung adenocarcinoma and the marginal/central ratio on Kaplan-Meier survival curves.

表3 多變量Cox風險比例模型分析巨噬細胞M2表型區(qū)域極化與預后的關系

我們研究中發(fā)現肺MIA和IA病例中邊緣區(qū)M2型巨噬細胞數量出現了明顯增多，AIS病例M2型巨噬細胞數量較前兩者有較明顯減少，說明肺腺癌邊緣區(qū)M2型巨噬細胞數量變化肺腺癌不同階段具有不同尋常的表現。我們發(fā)現邊緣區(qū)M2型巨噬細胞數量變化很可能與肺腺癌的侵襲浸潤能力呈正比關系，提示M2表型具有促進腫瘤侵襲的功能，是一種正向促進因素，反映其具有親腫瘤的傾向，這與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥細胞微環(huán)境相關[13]。糖皮質激素、IL-4、IL-13 和IL-10能誘導形成一個截然不同的M2巨噬細胞表型，其表達精氨酸酶I和表皮生長因子,促進血管形成，有利于組織重塑和浸潤，并能通過分泌IL-10抑制炎癥反應[14]。此外，M2型巨噬細胞極化機制可以參考一些基礎動物實驗的結論。例如王芳等[15]對糖尿病大鼠的課題研究發(fā)現巨噬細胞NO2-/NO3-生成量與巨噬細胞功能變化有關。但巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)介導的NO產生和iNOS的表達是否與M2型巨噬細胞極化聚集有一定關聯，仍需更多的臨床研究證實。

本研究課題單因素生存分析顯示肺腺癌邊緣區(qū)M2型巨噬細胞數量與肺腺癌的生存時間呈負相關。多變量Cox風險模型生存分析表明M2型巨噬細胞計數與患者的生存時間沒有獨立的統(tǒng)計學相關性。Welsh等[16]對175例患者的研究中發(fā)現，肺腺癌組織內巨噬細胞數量是一個強有利的獨立預后因素，巨噬細胞數量越多,預后越差。我們的實驗結果部分驗證了Welsh等的觀點。一項研究認為TAMs尤其是M2表型在腫瘤的轉移過程中有重要作用，并證明NSCLC中腫瘤相關巨噬細胞表達免疫抑制細胞因子IL-10是一種消極的預后因素，與腫瘤的淋巴結浸潤，晚期及低生存率相關[17]。本研究結果表明巨噬細胞M2表型在肺腺癌邊緣區(qū)浸潤可能與腫瘤侵襲浸潤有關，并對預后能造成一定影響。邊緣區(qū)巨噬細胞M2表型的極化可能是預測患者預后的較好的參考指標。肺腺癌的預后與Th1/Th2細胞因子失衡機制有關，肺腺癌腫瘤微環(huán)境能發(fā)生Th2細胞因子分泌的偏移。Th2因子能誘導巨噬細胞M2表型激活，抑制免疫系統(tǒng)，促進淋巴管增生，從而促進肺腺癌發(fā)生淋巴結轉移，對患者的預后產生消極影響[18]。包括肺腫瘤的數種惡性腫瘤，Th2細胞因子偏移與其惡性程度呈正相關[19]。巨噬細胞是可塑性細胞，例如,它們可以在激活的M1狀態(tài)和激活M2狀態(tài)間進行表型轉換，這取決于它們所處微環(huán)境特定的信號。因為IL-4是M2型極化巨噬細胞的激活因子，IL-10具有促進單核細胞發(fā)育成M2型巨噬細胞的功能[20]。因此下調邊緣區(qū)的M2型巨噬細胞數量可能有助于延緩肺腺癌進展，從而能達到改善患者短期預后的目標。

綜上所述，巨噬細胞M2表型在肺腺癌周邊交界處存在邊緣極化效應，其邊緣極化狀態(tài)和邊緣/中心比值是獨立的預后危險因素。因此，我們推測術前通過肺穿刺等手段對判斷邊緣極化狀態(tài)是一種可行的方法，而術后活檢檢測M2表型邊緣/中心比值則可能成為評估預后方法之一。這也為定向清除M2型巨噬細胞以緩解免疫抑制的新技術研究提供應用參考指征，從而在指導肺腺癌術后治療、改善預后方面發(fā)揮其積極的作用。

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Polarized distribution of M2 macrophages in marginal region around lung adenocarcinoma and its effect on prognosis

XIAO Wei-hua1, ZHAO Ling-ling2, YING Li-li2, MA Hai-fen1, WU Liang2, CHEN Guo-rong2

(1DepartmentofPathology,BeilunDistrictPeople’sHospitalinNingboCity,Ningbo315800,China;2DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:chengr1978@aliyun.com)

AIM: To explore the polarized distribution of M2 macrophages in the marginal region around lung adenocarcinoma, the marginal/central ratio and their effect on the prognosis. METHODS: Double immunohistochemistry staining was used to determine the distribution and the difference of CD163+/CD68+(M2) macrophages in the marginal and central regions in 49 cases of lung adenocarcinomainsitu(AIS), 11 cases of minimally invasive adenocarcinoma (MIA) and 57 cases of invasive adenocarcinoma (IA) in order to explore the effect and mechanism of the polarized distribution and the marginal/central ratio on the progression of lung adenocarcinoma. Single- factor Kaplan-Meier survival curve analysis and multivariate Cox survival analysis were employed to explore the relationship between the polarized distribution of M2 macrophages and the prognosis. RESULTS: Polarized aggregation of M2 macrophages was observed in the marginal region of lung adenocarcinoma compared with that in the central region, and the difference was significant (P<0.01). Based on the median level, they were divided into high polarized group and low polarized group. In low polarized group, M2 macrophage count in AIS was not significantly different from that in MIA or IA. However, in high polarized group, M2 macrophage count in AIS was lower than that in MIA and IA in turn and there were statistically significant differences (P<0.01). Single-factor Kaplan-Meier survival curve analysis and log-rank test result showed that the number of M2 macrophages in the marginal region and marginal/central ratio were negatively correlated to the survival time (2=44.71,P<0.01;2=21.75,P<0.01). Multivariate Cox survival analysis showed that the high polarized distribution of M2macrophages in the marginal region and the marginal/central ratio were independent risk factors for the prognosis (P<0.01). CONCLUSION: There is a polarization effect of M2 macrophages on the marginal region of lung adenocarcinoma. The marginal polarization and the marginal/central ratio are independent risk factors of the prognosis. Therefore, it may be an effective method for the evaluation of the prognosis to judge the marginal polarization by preoperative puncture and to determine the marginal/central ratio of M2 macrophages by postoperative biopsy.

Lung neoplasms; Macrophages; Polarization; Prognosis

1000- 4718(2015)01- 0160- 06

2014- 05- 11

2014- 07- 11

浙江省科學技術廳國際科技合作專項(合作研究)項目(No. 2013C24031)

△通訊作者 Tel: 0577-55579795; E-mail: chengr1978@aliyun.com

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.030