劉 蓮， 余榕捷， 戴 云， 曾智星， 郭曉令， 季青山， 鐘敬祥△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院眼科, 2生物工程研究所,廣東 廣州 510632)

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重組蛋白PTD-HSP27的制備及其穿細(xì)胞膜和角膜組織的功能研究*

劉 蓮1， 余榕捷2， 戴 云2， 曾智星2， 郭曉令2， 季青山1， 鐘敬祥1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院眼科,2生物工程研究所,廣東 廣州 510632)

目的： 制備PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿過人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04細(xì)胞膜及新西蘭大白兔的角膜組織進(jìn)入眼前房。方法: 利用重疊延伸PCR法獲得重組目的基因片段PTD-HSPB1-6His，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKYB-PTD-HSP27-6His，原核誘導(dǎo)PTD-HSP27蛋白表達(dá)及純化重組蛋白后對其進(jìn)行Western blotting鑒定；用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記重組蛋白PTD-HSP27并檢測其穿透SRA01/04細(xì)胞膜的能力及兔眼角膜組織的能力。結(jié)果: 成功構(gòu)建并純化制備目的蛋白PTD-HSP27，在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04細(xì)胞及結(jié)膜囊滴注PTD-HSP27兔眼前房內(nèi)均可檢測出重組蛋白PTD-HSP27。結(jié)論: 通過重疊延伸PCR法及鎳柱層析純化法可以獲得較純的重組蛋白PTD-HSP27；重組蛋白PTD-HSP27能夠穿透SRA01/04細(xì)胞膜及穿越兔眼角膜進(jìn)入房水。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域； 熱休克蛋白27； 反式轉(zhuǎn)錄激活因子； 晶狀體上皮細(xì)胞

熱休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)的低分子量使其隸屬于小分子熱休克蛋白家族，是由生物體(或離體培養(yǎng)細(xì)胞)在不良環(huán)境因素刺激下產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，它在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，對于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)維持、更新和修復(fù)等方面起到十分重要的保護(hù)細(xì)胞作用。反式轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activator of transcription, TAT)是一種帶有正電荷的短肽結(jié)構(gòu),TAT功能中最具吸引力的部分就是它可以幫助多種類型的大分子物質(zhì)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[1-3]。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain，PTD)是既往研究中已經(jīng)證實的TAT穿膜功能的關(guān)鍵序列，PTD具備有強(qiáng)大的穿膜活性，可以將與之連接的基因、多肽或蛋白質(zhì)高效快速地導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部，而被導(dǎo)入細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能均不受其影響[4]。本實驗研究主要是通過基因工程的原理和相關(guān)技術(shù)實現(xiàn)重組目的基因PTD-HSPB1-6His，表達(dá)并純化制備重組蛋白PTD-HSP27，并檢測PTD是否具備將HSP27帶入細(xì)胞內(nèi)甚至穿透動物角膜的能力，為后續(xù)研究重組蛋白PTD-HSP27的生物學(xué)功能提供前期基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和動物 編碼人HSP27的HSPB1基因模版質(zhì)粒購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司； pKYB質(zhì)粒、工程菌DH5和E.colistrain ER2566由暨南大學(xué)生物工程研究所保存； 人晶狀體上皮細(xì)胞(SRA01/04)由中山眼科中心惠贈； 新西蘭大白兔購自廣東省實驗動物中心。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、限制酶NdeI和XhoI以及PCR酶和T4連接酶均購自TaKaRa; 6His I抗購自Santa Cruz；Ni2+柱購自QIAGEN；FITC標(biāo)記試劑盒購自上海喜潤生化試劑公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 重組質(zhì)粒pKYB-PTD-HSP27-6His的構(gòu)建 根據(jù)HSPB1基因序列設(shè)計引物，上游引物為5’-XXX XXX CAT ATG TAT GGC CGT AAA AAA CGT CGT CAG CGT CGTCGT ACC GAG CGC CGC GTC CCC TTC TCG CTC-3’,下游引物為5’-XXX XXX CTC GAG TTA TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG CTT GGC GGC AGT CTC ATC GGA TT-3’，劃線部位分別為NdeI和XhoI的酶切位點，引物由Invitrogen合成。以HSPB1基因為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在HSP27蛋白的N端引入PTD短肽YGRKKRRQRRR，C端引入6個組氨酸的標(biāo)簽。

2.2 重組蛋白PTD-HSP27-6His的誘導(dǎo)表達(dá)、純化制備及Western blotting鑒定 將上步陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.colistrain ER2566中，得到原核表達(dá)菌株pKYB-PTD-HSP27-6His-ER2566后，將isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)終濃度分別調(diào)整至0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)菌E.colistrain ER2566表達(dá)目的蛋白。用SDS-PAGE(12%)檢測菌體超聲破碎后PTD-HSP27融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況，選擇可溶性PTD-HSP27融合蛋白含量最高者為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。Western blotting鑒定目的蛋白。將表達(dá)菌體上清緩慢滴入平衡后的Ni2+柱；用不同濃度(20、40、60、80、120、200 mmol/L)的咪唑緩沖液分步進(jìn)行洗脫，12% SDS-PAGE檢測，選擇雜蛋白明顯洗脫而無目的蛋白條帶的濃度為雜蛋白的咪唑洗脫濃度；選擇可見明顯目的蛋白條帶的洗脫濃度為目的蛋白最佳咪唑洗脫濃度。將融合蛋白用最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)表達(dá)并用最佳咪唑洗脫濃度進(jìn)行洗脫，將得到蛋白透析后置于真空冷凍干燥機(jī)制備重組蛋白PTD-HSP27的蛋白粉末，凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PTD-HSP27穿膜功能的驗證 利用FITC標(biāo)記試劑盒分別對PTD-HSP27和野生型HSP27進(jìn)行熒光標(biāo)記。待生長在6孔板上的SRA01/04細(xì)胞融合至80%左右時，分別加入含F(xiàn)ITC-PTD-HSP27和FITC-HSP27的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育2 h；用PBS液輕柔沖洗細(xì)胞片4次，每次10 min(避光操作)，在倒置熒光顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照。將RIPA裂解液加入到用FITC標(biāo)記后的重組蛋白PTD-HSP27孵育完成后的SRA01/04中，收集細(xì)胞裂解液。用熒光檢測儀檢測RIPA裂解后的細(xì)胞A495值，RIPA為作為空白對照，應(yīng)用公式計算進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記蛋白量(進(jìn)入細(xì)胞蛋白量=A495/蛋白標(biāo)記效率)。按以下公式計算蛋白穿膜效率：蛋白穿膜效率=進(jìn)入細(xì)胞的標(biāo)記蛋白量/每孔標(biāo)記蛋白總含量。將新西蘭大白兔按體重隨機(jī)分為2組： HPS27組和PTD-HSP27組，每組5只。PBS液沖洗兔眼結(jié)膜囊3次，在兔眼結(jié)膜囊滴入表面麻醉劑后進(jìn)入暗室，將FITC標(biāo)記的PTD-HSP27和野生型HSP27實驗樣品約200μL滴入兔眼結(jié)膜囊內(nèi)，使樣品充分浸潤整個眼球；1 h后，PBS液沖洗結(jié)膜囊3次，將1 mL注射器針頭自兔眼的角鞏緣部位穿刺進(jìn)入前房，緩慢吸取房水；將上述步驟吸取的房水裝入避光的EP管中，冷凍離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，取上清200 μL加入96孔板中，用熒光分光光度計檢測各個樣品在520 nm的熒光值，激發(fā)光495 nm；計算重組蛋白PTD-HSP27穿兔角膜效率(%)=(樣品熒光值-空白對照熒光值)/(標(biāo)記效率W ×蛋白上樣量)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒pKYB-PTD-HSP27的構(gòu)建和鑒定

利用引物對模板質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在已有的HSPB1基因N端連接穿膜片段PTD，C端連接用于蛋白純化標(biāo)記的6His基因片段，設(shè)計出的PTD-HSPB1-6His大小為669 bp，與圖中位置一致，說明擴(kuò)增出了目的基因(圖1A)；用NdeI和XhoI雙酶切對陽性克隆4進(jìn)行鑒定，切出預(yù)期大小的基因條帶，說明目的基因已連接在pKYB載體中(圖1B);經(jīng)菌落PCR鑒定得到陽性克隆為3、4、5號克隆(圖1C);對陽性克隆進(jìn)行測序檢測，BLAST序列比對顯示pKYB載體中含有序列正確的目的基因。

2 重組蛋白PTD-HSP27的誘導(dǎo)表達(dá)及其Western blotting鑒定

2.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度篩選 加入IPTG至終濃度分別為0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)3 h后，12% SDS-PAGE 檢測目的蛋白的表達(dá)結(jié)果，顯示IPTG濃度為0.6 mmol/L時最有利于PTD-HSP27的可溶性表達(dá)，蛋白分子量約為27 kD，見圖2。

Figure 1.Identification of expression plasmid pKYB-PTD-HSP27-6His. A: PCR amplification of recombinant PTD-HSP27-6His gene; B: identification of positive expression vector PTD-HSP27-6His digested by Nde I and Xho I； C: identification of the positive expression vector PTD- HSP27-6His by PCR.

Figure 2.Concentration screening of IPTG. M: protein marker; 1: uninduced bacteria; 2～5: supernatant of bacteria induced with 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8 mmol/L IPTG; 6～9: deposit of bacteria induced with 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8 mmol/L IPTG.

2.2 咪唑洗脫濃度篩選 采用Ni2+Trap Chelating HP 親合層析柱對目的蛋白PTD-HSP27進(jìn)行層析純化，通過對不同咪唑濃度梯度進(jìn)行篩選，得出目的蛋白的最佳咪唑洗脫濃度為200 mmol/L，可得到較純的重組蛋白PTD-HSP27(圖3)。由圖中所見，破碎后的菌體沉淀中仍有多量的PTD-HSP27存在，提示破碎不完全，可以進(jìn)一步改善細(xì)胞破碎條件以提高蛋白純化率。

Figure 3.Concentration screening of imidazole. 1： 200 mmol/L imidazole wash; M: protein marker; 2: uninduced bacteria; 3: bacteria induced with 0.6 mmol/L IPTG; 4: supernatant of bacteria induced with 0.6 mmol/L IPTG; 5: flow through nickel affinity column; 6: 20 mmol/L imidazole wash; 7: 40 mmol/L imidazole wash; 8: 60 mmol/L imidazole wash; 9: 80 mmol/L imidazole wash.

2.3 重組蛋白PTD-HSP27-6His的制備及Western blotting鑒定 依照上述篩選后的優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度及蛋白純化條件，用500 mL搖瓶的液體LB培養(yǎng)基對工程菌pKYB-PTD-HSP27-ER2566進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，Ni2+柱層析純化蛋白PTD-HSP27，經(jīng)過透析和真空冷凍干燥后制備成PTD-HSP27蛋白干粉。用6His抗體對重組蛋白干粉進(jìn)行Western blotting檢測,結(jié)果顯示制備出正確的帶有6His標(biāo)簽的重組蛋白PTD-HSP27，見圖4。

3 重組蛋白PTD-HSP27的穿膜能力檢測

3.1 重組蛋白PTD-HSP27的穿細(xì)胞膜的能力和效率檢測 將重組蛋白PTD-HSP27和野生型HSP27分別進(jìn)行FITC標(biāo)記后與SRA01/04細(xì)胞孵育，用倒置熒光顯微鏡觀察拍攝，可見PTD-HSP27組在細(xì)胞內(nèi)有大量熒光，但HSP27組中的細(xì)胞內(nèi)沒有顯著的熒光信號，此實驗結(jié)果表明重組PTD-HSP27能夠順利通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)果顯示:重組PTD-HSP27進(jìn)入細(xì)胞效率為(46.32±2.74)%；沒有帶入膜信號的HSP27進(jìn)入細(xì)胞效率約為(6.10±1.12)%，2組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01),見圖5。

Figure 4.SDS-PAGE (12%) analysis and Western blotting identification of preparation and purification of PTD-HSP27. M: protein marker; 1: uninduced bacteria; 2: supernatant of bacteria induced by IPTG; 3: precipitation of bacteria induced by IPTG; 4: flow through nickel affinity column; 5: 40 mmol/L imidazole wash; 6: 80 mmol/L imidazole wash; 7: 120 mmol/L imidazole wash; 8： the target protein PTD-HSP27 eluted with 200 mmol/L imidazole; 9: purified recombinant PTD-HSP27 dialysed with distilled water; 10: Western blotting identification of the purified recombinant PTD-HSP27.

Figure 5.Penetrating ability and efficiency of the fusion protein PTD-HSP27. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs HSP27.

3.2 重組蛋白PTD-HSP27的穿兔角膜能力和效率檢測 按實驗方法所述標(biāo)記重組蛋白PTD-HSP27和野生型HSP27，在新西蘭大白兔結(jié)膜囊中分別滴入FITC標(biāo)記的HSP27和PTD-HSP27，取房水檢測各個樣品在520 nm的熒光值?？梢姡篜TD-HSP27組和HSP27組在兔眼前房的房水熒光值分別為88 978.35±5 069.04和13 368.34±1 025.32。PTD-HSP27組房水熒光值明顯高于HSP27組，組間比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。PTD-HSP27穿兔角膜的效率為(27.31±1.94)%，HSP27穿兔角膜的效率為(4.37±1.07)%，兩組之間比較有顯著差異(P<0.01)，說明天然HSP27的通過角膜進(jìn)入眼內(nèi)的能力并不高，而PTD可有效介導(dǎo)HSP27穿過兔眼角膜進(jìn)入眼內(nèi),見圖6。

討 論

細(xì)胞膜的主要功能是將細(xì)胞的內(nèi)部環(huán)境和外部環(huán)境隔開，這一功能可以保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定從而維持細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。除了一些可以自由穿梭于細(xì)胞內(nèi)外的小分子物質(zhì)外，細(xì)胞外的各種成分進(jìn)入細(xì)胞都需要通過受體、離子通道、胞吞等方法。由于細(xì)胞膜對細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的這種選擇透過性，使得很多具備特定生物學(xué)活性作用的蛋白質(zhì)和多肽等物質(zhì)難以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或到達(dá)組織的靶點位置，細(xì)胞膜的選擇透過性在很大程度上限制了這些蛋白質(zhì)和多肽發(fā)揮作用。

1988年，Green等[1]和Frankel等[2]首次發(fā)現(xiàn)TAT能主動穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核。1997年，Vivès等[4]發(fā)現(xiàn)氨基酸YGRKKRRQRRR片段與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)，是穿膜能力的關(guān)鍵功能區(qū)，也是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的最小單位，將之稱為PTD。 1994年,Fawell等[3]發(fā)現(xiàn)，通過與TAT以共價方式結(jié)合，異源蛋白可以被TAT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi), 這一結(jié)果意味著TAT具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性。1999年Schwarze等[5]首次在體內(nèi)證實了PTD的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。此后的研究證實，與PTD結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)及DNA可以被高效快速地導(dǎo)入細(xì)胞，這種方式具有濃度依賴性，被導(dǎo)入細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)以及功能并未受到影響[[6]。2007年，Delom等[7]首次發(fā)現(xiàn)外源蛋白可以通過PTD的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用進(jìn)入秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的腸上皮細(xì)胞，這意味著PTD的跨膜功能不具有物種特異性。

Figure 6.Fluorescence intensity of rabbit aqueous humor and penetrating efficiency of the fusion protein PTD-HSP27. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs HSP27.

隨著對TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的深入研究，研究者們開始以共價鍵或融合蛋白的形式利用PTD攜帶各種目的蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果證實PTD介導(dǎo)的重組蛋白均能被有效地導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)[8-10]。由于能夠介導(dǎo)作為多肽和蛋白質(zhì)等大分子藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并且穿過血腦屏障，PTD開始更多地被應(yīng)用于攜帶治療某些疾病的藥物進(jìn)入細(xì)胞和組織，從而達(dá)到治療疾病的目的，已有研究人員構(gòu)建了融合蛋白PTD-caspase-3, 用來治療艾滋病[11]。

后基因組時代的主要研究方向和重點是利用基因組編碼形成的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，PTD在這一領(lǐng)域可以起到重要的作用。由于PTD能夠?qū)⒒虻木幋a產(chǎn)物蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，繞過核酸的參與，從而可以更直接地表現(xiàn)出蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。因此，TAT-PTD融合蛋白系統(tǒng)被認(rèn)為是一種非常具有前途的物質(zhì)運載工具，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究以及生物制藥的臨床治療等方面都有著非常廣泛的應(yīng)用前景[12]。

關(guān)于重組蛋白PTD-HSP27的構(gòu)建及作用研究，國際上報道中提出在HSP27的C端加入PTD短肽的重組蛋白PTD-HSP27具有穿膜的活性[13-14]，本實驗研究中首次將PTD短肽加入到HSP27的N端，借以構(gòu)建含有穿膜肽的HSP27，結(jié)果也證實了利用重疊延伸PCR 技術(shù)，可以成功地在已有的編碼人HSP27的HSPB1基因N端和C端分別加入PTD基因和6個組氨酸的蛋白純化標(biāo)簽，經(jīng)過蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化等相關(guān)實驗步驟，成功獲得了純化的重組蛋白PTD-HSP27，并用Western blotting及測序等方法鑒定其表達(dá)正確。研究中利用重疊延伸PCR技術(shù)等基因工程的原理和技術(shù)，根據(jù)己知的編碼人HSP27蛋白與PTD的基因序列，設(shè)計出重組蛋白PTD-HSP27的編碼基因，采用重疊延伸PCR法將PTD與6個組氨酸的蛋白純化標(biāo)簽連接在編碼HSP27的基因上，構(gòu)建出蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白；用蛋白層析法對目的蛋白進(jìn)行純化制備并檢測其生物學(xué)活性，結(jié)合鎳柱蛋白純化技術(shù)要點，形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的PTD-HSP27蛋白的制備思路，為重組蛋白PTD-HSP27的生物制藥研發(fā)與臨床藥物應(yīng)用提供前期的實驗室基礎(chǔ)。本實驗結(jié)果顯示重組蛋白PTD-HSP27 可以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時也證實其具備天然HSP27蛋白所不具備的可以順利穿越角膜進(jìn)入兔眼房水內(nèi)的能力，這一結(jié)果也進(jìn)一步證實了本實驗中首次成功重組并純化制備的N端連接PTD的重組蛋白PTD-HSP27具有穿膜的生物學(xué)活性，且蛋白穿膜活性好，可以穿過HLECs細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并穿過兔角膜組織進(jìn)入眼前房，為后期入膜后的重組蛋白對細(xì)胞及眼部組織的作用研究以及相關(guān)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Preparation of recombinant PTD-HSP27 and verification of its ability to penetrate the cell membrane of human lens epithelial cells and rabbit cornea

LIU Lian1, YU Rong-jie2, DAI Yun2, ZENG Zhi-xing2, GUO Xiao-ling2, JI Qing-shan1, ZHONG Jing-xiang1

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital，2InstituteofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:zjx85221206@126.com)

AIM: To construct the prokaryotic expression system containing protein transduction domain (PTD) with heat shock protein 27 (HSP27) in order to prepare and purify the recombinant protein, and to verify whether the recombinant protein PTD-HSP27 has the ability to penetrate the human lens epithelial cell (HLEC) membrane and the rabbit cornea. METHODS: The plasmid pKYB-PTD-HSPB1-6His was constructed by the technique of overlap extension PCR. The plasmid was transformed and PTD-HSP27 was purified through nickel affinity chromatography column and identified by Western blotting. PTD-HSP27-6His was labeled with the fluorescein isothiocyanate (FITC). The penetrating ability of PTD-HSP27 into HLECs and rabbit cornea was tested. RESULTS: The recombinant PTD-HSP27 plasmid was successfully cloned and effectively expressed. The correctness of the recombinant protein PTD-HSP27 was demonstrated. Fluorescence microscopic examination showed that PTD-HSP27-FITC was internalized by HLECs. Fluorescent labeled PTD-HSP27 was then observed in the rabbit aqueous humor. CONCLUSION: The recombined genePTD-HSPB1 was constructed by overlap extension PCR technique and the PTD-HSP27 fusion protein was prepared and purified by nickel affinity chromatography column. Using the technique of PTD-fusion protein, HSP27 was transduced into HLECs and passed through the cornea.

Protein transduction domain; Heat shock protein 27;Trans-activators of transcription; Lens epithelial cells

1000- 4718(2015)01- 0135- 06

2014- 05- 06

2014- 11- 08

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No. 2011CB707501); 廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. S2013010016037)

△通訊作者 Tel： 020-38688005； E-mail： zjx85221206@126.com

R363； R77

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.026