劉 翔，曾柳苑，林 虹

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510260)

AIF-1及IL-1β在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)表達(dá)的研究

劉 翔，曾柳苑，林 虹

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510260)

目的探討同種異體移植物炎癥因子-1(AIF-1)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β）在潰瘍性結(jié)腸炎致病機(jī)制中的作用。方法90只BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組，每組30只，第1組用葡聚糖硫酸鈉(DSS)造模為潰瘍性結(jié)腸炎，第2組用大腸桿菌造模為細(xì)菌性腸炎，第3組為正常對(duì)照，取得各組小鼠的外周血及結(jié)腸標(biāo)本，用ELISA的方法檢測(cè)AIF-1、IL-1β的表達(dá)，比較其在三組小鼠體內(nèi)表達(dá)的差異。結(jié)果(1)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠AIF-1表達(dá)水平分別為外周血中(0.134±0.048)ng/ml，結(jié)腸中(0.462±0.117)ng/ml，均較細(xì)菌性腸炎[外周血中(1.425±0.229)ng/ml、結(jié)腸中(1.261±0.48)]ng/ml高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；(2)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠IL-1β表達(dá)分別為外周血中(0.894±0.173)ng/ml，結(jié)腸中(1.261±0.048)ng/ml，與細(xì)菌性腸炎[外周血中(0.087±0.021)ng/ml、結(jié)腸中(0.149±0.057)ng/ml]比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；(3)潰瘍性結(jié)腸炎及細(xì)菌性腸炎小鼠AIF-1與IL-1β表達(dá)水平無相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論AIF-1可能參與了潰瘍性結(jié)腸炎的特異性致病機(jī)制，IL-1β可能未參與特異性致病機(jī)制。

同種異體移植物炎癥因子-1；白細(xì)胞介素-1β；潰瘍性結(jié)腸炎；致病機(jī)制

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是當(dāng)今胃腸病學(xué)研究中的熱點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制至今尚無定論。已有的結(jié)果顯示遺傳背景、結(jié)腸內(nèi)微生態(tài)、宿主免疫因素均參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病，其中免疫因素在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中占據(jù)的地位越來越受到人們的重視，甚至有較為前沿的觀點(diǎn)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎與自身免疫有著密切聯(lián)系[1-2]。同種異體移植物炎癥因子-1 (Allograft inflammatory factor-1)是新近發(fā)現(xiàn)的和機(jī)體免疫有關(guān)的炎癥因子，已有動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)其參與了小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的病理過程，但其是否參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病目前尚無相關(guān)研究，有必要對(duì)此進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 90只SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄各半，8～10周齡，體重(25±5)g，來源于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 材料和儀器 葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium，DSS)購(gòu)于Sigma公司，大腸桿菌菌株購(gòu)自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心。ELISA試劑盒：IL-1β(Interleukin-1β，白細(xì)胞介素-1β)(深圳晶美公司，批號(hào)：2014153)，AIF-1(深圳晶美公司，批號(hào)：2014187)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 90只小鼠，隨機(jī)分為三組，每組30只，第1組予5%DSS溶液自由飲用造模為潰瘍性結(jié)腸炎，第2組予大腸桿菌菌液灌胃造模為細(xì)菌性腸炎，第3組正常對(duì)照組。小鼠均于實(shí)驗(yàn)第12天時(shí)處死，眼球取血、無菌解剖取結(jié)腸組織用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 AIF-1、IL-1β表達(dá)水平的測(cè)定 采用試劑盒推薦的雙抗體夾心ELISA法。處理好血和結(jié)腸組織樣本后，將預(yù)包被好的抗AIF-1或IL-1β單抗酶標(biāo)板上分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，結(jié)合后加入抗AIF-1或IL-1β抗體，形成免疫復(fù)合物后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Steptavidin，最后加入酶底物顯色，492 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品中的AIF-1或IL-1β濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)正態(tài)性，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較前檢驗(yàn)方差齊性(以α=0.1為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＞0.1則方差齊)，各組方差齊時(shí)用LSD法進(jìn)行均數(shù)比較，各組方差不齊時(shí)用Dunnett T3進(jìn)行均數(shù)比較。相關(guān)性分析用Pearson法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中AIF-1的表達(dá) 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血中AIF-1的表達(dá)水平較細(xì)菌性腸炎小鼠為高(F=22.17，P＜0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)。潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中AIF-1表達(dá)水平較細(xì)菌性腸炎小鼠高(F= 16.25，P＜0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)，見圖1、表1。

圖1 ELISA檢測(cè)各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中AIF-1(±s)

表1 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中AIF-1的表達(dá)(±s，ng/ml)

表1 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中AIF-1的表達(dá)(±s，ng/ml)

組別 外周血AIF-1結(jié)腸AIF-1潰瘍性結(jié)腸炎組(n=30)細(xì)菌性腸炎組(n=30)正常對(duì)照組(n=30) 0.134±0.048ab0.087±0.021a0.017±0.004 0.462±0.117ab0.149±0.057a0.053±0.024

2.2 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中IL-1β的表達(dá) 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血中IL-1β的表達(dá)水平與細(xì)菌性腸炎差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.91，P＞0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)。潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中IL-1β表達(dá)水平與細(xì)菌性腸炎差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.14，P＞0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)，見圖2、表2。

2.3 各組小鼠AIF-1與IL-1β表達(dá)的相關(guān)性 在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中，外周血內(nèi)AIF-1與IL-1β表達(dá)水平無相關(guān)性(r=0.14，P＞0.05)，結(jié)腸組織中AIF-1與IL-1β表達(dá)水平無相關(guān)性(r=0.19，P＞0.05)。在細(xì)菌性腸炎小鼠中，外周血內(nèi)AIF-1與IL-1β表達(dá)水平無相關(guān)性(r=0.22，P＞0.05)，結(jié)腸組織中AIF-1與IL-1β表達(dá)水平無相關(guān)性(r=0.07，P＞0.05)。

圖2 ELISA檢測(cè)各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中IL-1β

表2 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中IL-1β的表達(dá)(±s，ng/ml)

表2 各組小鼠外周血和結(jié)腸組織中IL-1β的表達(dá)(±s，ng/ml)

注：a與正常組比較，P＜0.05；b與細(xì)菌性腸炎組比較，P＞0.05。

組別潰瘍性結(jié)腸炎組(n=30)細(xì)菌性腸炎組(n=30)正常對(duì)照組(n=30)外周血IL-1β0.894±0.173ab0.728±0.225a0.127±0.051結(jié)腸IL-1β1.261±0.48ab1.425±0.229a0.195±0.048

3 討 論

流行病學(xué)研究顯示，我國(guó)的潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率呈逐年增多的趨勢(shì)，潰瘍性結(jié)腸炎是一種發(fā)生于腸道的持續(xù)性炎癥疾病，在青壯年中多發(fā)。潰瘍性結(jié)腸炎具有發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、無法進(jìn)行預(yù)防、目前缺乏特效治療手段、無法根除等特點(diǎn)，造成了較高的致病、致殘率，不但給患者帶來痛苦，而且對(duì)醫(yī)療資源及社會(huì)資源也是極大的消耗，因此，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制便成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，明確其機(jī)制有助于找出特異性的治療靶點(diǎn)。

已有大量研究表明，免疫反應(yīng)是潰瘍性結(jié)腸炎致病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病后各種炎癥因子如白介素、腫瘤壞死因子、趨化因子的活化構(gòu)成了腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)維持的基礎(chǔ)。也有部分研究認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎類似于自身免疫性疾病，其炎癥反應(yīng)機(jī)制是基于自身抗體的存在[2]。因此，尋找自身免疫分子對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的影響，便成為了一種可行的研究方向。AIF-1被證實(shí)是一種有著多種功能的重要炎癥因子，其在器官移植后排異、腫瘤、微生物感染等疾病的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用[3]，更令人興奮的是，許多自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎[4]等都被發(fā)現(xiàn)有AIF-1參與的機(jī)制?？紤]到潰瘍性結(jié)腸炎存在著自身免疫方面的異常，且免疫因素對(duì)其發(fā)病產(chǎn)生著強(qiáng)大的影響，那AIF-1所調(diào)控的免疫反應(yīng)是否也參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病？

本研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠模型體內(nèi)，其腸道組織和外周血內(nèi)的AIF-1表達(dá)均較正常小鼠為高，同時(shí)IL-1β的表達(dá)也同步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠發(fā)病后其體內(nèi)自身免疫反應(yīng)已被激活，這與已有的研究是基本一致的[5-6]。而在普通的細(xì)菌性腸炎小鼠模型體內(nèi)，其腸道組織和外周血內(nèi)的AIF-1、IL-1β亦有同步升高，這就證實(shí)了AIF-1能夠參與炎癥反應(yīng)的觀點(diǎn)，AIF-1確實(shí)可以作為炎癥反應(yīng)活躍程度的重要指標(biāo)之一。

更令人感興趣的是，同為小鼠結(jié)腸炎模型，潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠體內(nèi)無論是腸道組織還是外周血內(nèi)，AIF-1的表達(dá)均較細(xì)菌性腸炎小鼠為高，這一結(jié)果向我們提示了一個(gè)重要線索：作為來源于同種異體免疫反應(yīng)且其序列高度保守的炎癥因子，AIF-1對(duì)有著自身免疫背景的疾病更為敏感，因?yàn)橐延械难芯匡@示，潰瘍性結(jié)腸炎與細(xì)菌性腸炎比較起來，前者更加存在著特異性的免疫反應(yīng)，尤其是與自身免疫相關(guān)的反應(yīng)，而后者的炎癥反應(yīng)相對(duì)來說缺乏特異性?？紤]到這一特性，AIF-1可能參與了機(jī)體特異性的免疫反應(yīng)機(jī)制，在潰瘍性結(jié)腸炎中，則表現(xiàn)為參與了其特異性的免疫致病機(jī)制。同時(shí)，AIF-1的表達(dá)高低可以作為衡量特異性免疫反應(yīng)或者自身免疫水平的指標(biāo)[7]，當(dāng)炎癥反應(yīng)局限于非特異性時(shí)，AIF-1僅低滴度表達(dá)，而一旦自身免疫反應(yīng)或者某種特異性炎癥反應(yīng)啟動(dòng)，AIF-1迅速作出應(yīng)答，形成高滴度表達(dá)。如果在以后的研究中如能擴(kuò)展至臨床，證實(shí)AIF-1在潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)為高滴度表達(dá)而在非特異性腸炎患者體內(nèi)為低滴度表達(dá)，則可更為有力的證實(shí)此點(diǎn)假說。

與之相對(duì)照的是IL-1β，IL-1β一直被認(rèn)為是非特異性炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，其在諸多免疫反應(yīng)中起著介導(dǎo)作用，但缺乏特異性。本實(shí)驗(yàn)中雖然觀察到IL-1β在潰瘍性結(jié)腸炎和細(xì)菌性腸炎的小鼠體內(nèi)均有表達(dá)，但二者表達(dá)水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與AIF-1的表達(dá)水平差異形成鮮明對(duì)照，說明IL-1β雖然參與了結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制，但其相對(duì)來說缺乏特異性，很可能在炎癥通路中處于下游水平，并不能作為上游特異性啟動(dòng)機(jī)制存在[8]。而AIF-1與IL-1β之間無明顯相關(guān)性亦說明了這一點(diǎn)，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的地位，AIF-1確實(shí)可能較IL-1β更為特異性且更為上游層次。AIF-1至IL-1β的這一炎癥反應(yīng)及傳導(dǎo)通路，確實(shí)有值得進(jìn)一步探索的價(jià)值。

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Research of AIF-1 and IL-1β expression in mice with ulcerative colitis in vivo.

LIU Xiang,ZENG Liu-yuan,LIN Hong.Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the roles of allograft inflammatory factor-1(AIF-1)and interleukin-1β(IL-1β)in the pathogenesis of ulcerative colitis.MethodsNinety BALB/c mice were randomly divided into three groups,each with 30 mices.In group 1,dextran sulphate sodium(DSS)was applied for modeling of ulcerative colitis, andE.coliwas applied for modeling of bacterial enteritis in Group 2.Group 3 was set as the normal control.Peripheral blood samples and colon tissues of mice were collected for detection of AIF-1 and IL-1βexpression level by ELISA.Results(1)In group 1,AIF-1 expression levels were(0.134±0.048)ng/ml in peripheral blood and(0.462±0.117)ng/ml in colon tissues,which were significantly higher than the levels in group 2[(1.425±0.229)ng/ml in peripheral blood, (1.261±0.48)ng/ml in colon tissues],P＜0.05.(2)There was no statistically significant difference in IL-1βexpression level between group 1[(0.894±0.173)ng/ml in peripheral blood,(1.261±0.048)ng/ml in colon tissues]and group 2 [(0.087±0.021)in peripheral blood,(0.149±0.057)in colon tissues],P＞0.05.(3)AIF-1 and IL-1βexpression levels in mice of bacterial enteritis or ulcerative colitis had no relevance(P＞0.05).ConclusionAIF-1 might be involved in the specific pathogenesis of ulcerative colitis,and IL-1βmay not participate in the pathogenesis.

Allograft inflammatory factor-1(AIF-1);Interleukin-1β(IL-1β);Ulcerative colitis;Pathogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）21—3124—03

2015-03-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1137

劉 翔。E-mail：liuxiang317@sohu.com