雷賢英，李雨昕，雷賢蓉，甘辭海，胡麗蓉，薛鈺婷

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院ICU，四川 瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院供應(yīng)室，四川 瀘州 646000)

·論 著·

地塞米松對早期脂多糖大鼠肝組織髓樣分化蛋白2及核因子-κB表達(dá)的影響

雷賢英1，李雨昕2，雷賢蓉3，甘辭海1，胡麗蓉1，薛鈺婷1

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院ICU，四川 瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院供應(yīng)室，四川 瀘州 646000)

目的觀察地塞米松對脂多糖大鼠早期急性肝損傷時(shí)肝組織髓樣分化蛋白2(MD-2)基因及核因子-κB(NF-κB)蛋白表達(dá)的影響。方法15只雄性SD大鼠被隨機(jī)分為正常組、脂多糖組和治療組（脂多糖+地塞米松組），每組各5只。自大鼠尾靜脈穿刺置留置針以備給藥，正常組自大鼠尾靜脈注射生理鹽水10ml；脂多糖組靜脈注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)；治療組靜脈注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)和地塞米松0.1mg/kg。所有大鼠均于注射后1 h被處死，抽取左心室血行生化檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。剪取部分肝右葉制成肝組織勻漿液(保存于-20℃條件下以備用)，以檢測肝組織MD-2基因，另取部分肝組織檢測NF-κB蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果(1)正常組大鼠轉(zhuǎn)氨酶值波動于正常范圍，脂多糖組大鼠ALT、AST明顯增高，與脂多糖組比較，治療組轉(zhuǎn)氨酶值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；(2)正常的肝組織中可見少量MD-2基因、NF-κB蛋白表達(dá)；與正常組比較，脂多糖組和治療組肝組織MD-2基因及NF-κB蛋白的表達(dá)水平均明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但治療組MD-2基因及NF-κB蛋白的表達(dá)較脂多糖組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論早期脂多糖大鼠發(fā)生急性肝損傷時(shí)，地塞米松對其有明顯的治療作用，其治療機(jī)制可能與MD-2基因和NF-κB蛋白表達(dá)水平的減少有關(guān)。

脂多糖；髓樣分化蛋白2；核因子-κB(NF-κB)；急性肝損傷；地塞米松

膿毒癥因其高發(fā)病率、高死亡率嚴(yán)重威脅了危重患者的生命，是導(dǎo)致ICU重?；颊咚劳龅氖孜辉颉Ｈ硌装Y反應(yīng)綜合征是膿毒癥的主要病理生理機(jī)制，當(dāng)嚴(yán)重感染引起大量炎性介質(zhì)釋放引發(fā)膿毒癥級聯(lián)反應(yīng)時(shí)，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被持續(xù)激活，處于炎癥上游的調(diào)控蛋白髓樣分化蛋白2(Myeloid differentiation protein-2，MD-2)和大量炎癥反應(yīng)基因表達(dá)的控制點(diǎn)核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)均大量表達(dá)出來，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生多器官功能損傷甚至衰竭。本實(shí)驗(yàn)用地塞米松進(jìn)行干預(yù)，研究其對早期脂多糖大鼠MD-2基因及NF-κB蛋白表達(dá)的影響，探討地塞米松在膿毒癥救治中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料 地塞米松注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司，5mg/ml，批號H41020036)；脂多糖(血清型O111和B4，購于Sigma公司)用5%GS配制。LATaqwith GC Buffer PCR試劑盒、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver3.0試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 雄性、健康SD大鼠15只(體重200～250 g)均購自瀘州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。15只大鼠按照完全隨機(jī)化原則被分為正常組、脂多糖組以及治療組(脂多糖+地塞米松組)，每組各5只。

1.2.2 建立動物模型和取材 自清醒大鼠尾靜脈穿刺放置留置針，用肝素水封管后固定導(dǎo)管以備給藥。隨后自留置針導(dǎo)管注射藥物：正常組注射生理鹽水10ml；脂多糖組注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)；治療組注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)和地塞米松0.1mg/kg。所有大鼠均在注射后1 h被處死，抽取左心室血行生化檢測。剪取部分肝右葉制成肝組織勻漿液(保存于-20℃條件下以備用)；另取部分肝組織用甲醛固定。

1.2.3 MD-2 mRNA表達(dá)的檢測 用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)方法進(jìn)行檢測：取保存于-20℃條件下的肝組織勻漿液，將0.5 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，采用PCR儀分析基因表達(dá)。引物設(shè)計(jì)用Olig 6.0和Primer 5.0軟件(見表1)，用BLAST檢測引物特異性，根據(jù) GeneBank中 MD-2(ACCESSION：AY963291)、β-actin(ACCESSION：BC002409)、GAPDH(ACCESSION：NM_002046)序列，用凝膠定量分析軟件Gel-Pro analyzer 4.0來檢測RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的OD值，即光密度值。

表1 MD-2基因

1.2.4 肝組織NF-κB蛋白表達(dá)水平的檢測 將甲醛固定后的肝組織標(biāo)本石蠟包埋后切成5 μm厚切片。免疫組化法采用EnVision二步法，石蠟切片脫蠟至水后，在3%H2O2中進(jìn)行室溫孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕冼3遍，滴加正常山羊血清工作液，再在37℃條件下孵育1 h，去掉血清，滴加1：100稀釋的一抗(兔抗人)，在4℃下過夜后洗滌，滴加酶二抗聚合物，然后室溫下孵育40min，最后洗滌DAB顯色5min，終止顯色后用自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水封片。用日本OLYMPUS生物顯微鏡采集圖像進(jìn)行結(jié)果判讀，在高倍鏡下(×400)選取不少于5個(gè)不重疊的視野，對圖像進(jìn)行分析(用Lmage-Pro Plus軟件)，計(jì)算陽性表達(dá)面積占待測總面積的百分比，求和后得到平均值，即可得出大鼠肝組織NF-κB蛋白的表達(dá)值。

1.2.5 轉(zhuǎn)氨酶的檢測 將采集的各組大鼠左心室血行生化檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用隨機(jī)分組設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠轉(zhuǎn)氨酶比較 正常組大鼠ALT、AST值波動于正常范圍，脂多糖組大鼠ALT、AST值明顯增高，與脂多糖組比較，治療組轉(zhuǎn)氨酶值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠轉(zhuǎn)氨酶比較(U/L，±s)

表2 各組大鼠轉(zhuǎn)氨酶比較(U/L，±s)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與脂多糖組比較，bP＜0.05。

組別ALT例數(shù)AST正常組脂多糖組治療組F值P值37.4±12.7 102.3±20.9a79.3±16.8ab18.462 0.000 34.6±17.5 103.5±19.7a80.4±16.25ab19.217 0.000 555

2.2 各組大鼠MD-2基因、NF-κB蛋白表達(dá)情況 正常的肝組織中可見少量MD-2基因、NF-κB蛋白表達(dá)；與正常組比較，脂多糖組和治療組肝組織MD-2基因和NF-κB蛋白的表達(dá)水平均明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但治療組MD-2基因及NF-κB蛋白的表達(dá)較脂多糖組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠MD-2基因及NF-κB蛋白陽性表達(dá)水平比較(%，±s)

表3 各組大鼠MD-2基因及NF-κB蛋白陽性表達(dá)水平比較(%，±s)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與脂多糖組比較，bP＜0.05。

組別 例數(shù)MD-2基因NF-κB正常組脂多糖組治療組F值P值555 0.211±0.051 10.721±0.082a0.574±0.091ab57.616 0.000 0.350±0.079 1.232±0.104a0.914±0.074ab132.427 0.000

3 討論

MD-2是一種天然的對免疫具有調(diào)節(jié)作用的蛋白，當(dāng)細(xì)菌感染機(jī)體時(shí)，MD-2 mRNA的表達(dá)上調(diào)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[1]。MD-2具有相當(dāng)大的生物學(xué)功能價(jià)值，在炎癥、感染、免疫等病理生理過程中作用尤為明顯[2]，在識別配體和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的過程中起著非常重要的作用。MD-2是TLR4介導(dǎo)的LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種索狀分化輔助蛋白，TLR4是脂多糖(LPS)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，它們最終形成LPS-TLR4-MD-2復(fù)合物受體[3]，共同完成介導(dǎo)脂多糖(LPS)炎癥信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，MD-2能增強(qiáng)細(xì)胞上TLR4對LPS的反應(yīng),最終引起機(jī)體NF-κB的激活，啟動機(jī)體大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和釋放。作為炎癥反應(yīng)樞紐點(diǎn)的NF-κB，與炎癥因子互為因果，導(dǎo)致機(jī)體促炎與抗炎失衡，最終引起大量TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子釋放和表達(dá)以及炎癥瀑布式級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[4-5]，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征?？梢?，MD-2和NF-κB在這個(gè)炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中起著重要作用。隨著對MD-2和NF-κB在結(jié)構(gòu)和功能方面的深入研究，MD-2和NF-κB很可能作為全身炎癥綜合征治療中的“新靶點(diǎn)”，成為研究的“熱點(diǎn)”。

NF-κB在全身炎癥反應(yīng)中起著重要作用，它參與了炎性細(xì)胞因子如TNF-α等的基因轉(zhuǎn)錄過程，是重要的細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子。在一般情況下，NF-κB與胞漿中的抑制蛋白IκB結(jié)合，形成一種非激活狀態(tài)，當(dāng)脂多糖、TNF-α等炎癥分子刺激細(xì)胞時(shí)，IκB磷酸化后被降解，NF-κB與IκB分離后迅速活化、再磷酸化，通過核孔復(fù)合體受體，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合細(xì)胞核上的目標(biāo)基因結(jié)合位點(diǎn)，開始了一系列啟動和調(diào)控炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的過程，引起全身爆發(fā)性的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟和其他器官的損傷。在膿毒癥患者中，NF-κB的活化起著關(guān)鍵作用[6-7]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖復(fù)制膿毒癥大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脂多糖組肝組織MD-2 mRNA和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高，脂多糖組大鼠肝功能損害重，轉(zhuǎn)氨酶上升明顯。

地塞米松是一種重要的類固醇激素，屬于糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)，是由腎上腺皮質(zhì)分泌的，它在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和自我穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及細(xì)胞存活等方面扮演著重要的角色。治療劑量的糖皮質(zhì)激素能夠降低脫顆粒反應(yīng)，減少組胺和花生四烯酸的釋放，具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜、溶酶體膜、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，在膿毒癥時(shí)可以起到保護(hù)臟器的作用。在早期膿毒癥大鼠急性肺損傷的模型中，地塞米松治療組肺水通道蛋白1基因表達(dá)上調(diào)，肺濕、干重比值降低，血?dú)夥治鰠?shù)(包括PaO2、pH值等)均有明顯的改善[8]。同時(shí)，在地塞米松和異丙酚在早期膿毒癥大鼠的聯(lián)合應(yīng)用中，也證實(shí)地塞米松和異丙酚具有協(xié)同抗炎作用，對抗炎因子IL-10的表達(dá)有上調(diào)作用，對促炎因子TNF-α等的表達(dá)具有明顯的下調(diào)作用[9]。一系列研究均顯示，在嚴(yán)重感染的膿毒癥模型中使用糖皮質(zhì)激素可在呼吸生理、抗炎及臟器保護(hù)等方面均顯著獲益。本課題在以上研究基礎(chǔ)上，用脂多糖復(fù)制膿毒癥大鼠急性肝損傷模型，就地塞米松在膿毒癥時(shí)的臟器保護(hù)作用機(jī)制作了進(jìn)一步深入的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地塞米松對早期脂多糖大鼠急性肝損傷有臟器保護(hù)作用，治療劑量的地塞米松能夠下調(diào)肝組織MD-2和NF-κB的表達(dá)水平，降低大鼠轉(zhuǎn)氨酶。MD-2基因和NF-κB蛋白的下調(diào)可能是地塞米松在早期脂多糖大鼠急性肝損傷時(shí)臟器保護(hù)和抗炎的重要機(jī)理所在。

綜上所述，隨著地塞米松治療膿毒癥機(jī)理的逐漸深入，膿毒癥的傳統(tǒng)治療除了早期集束化治療、積極抗感染、抗休克、糾正內(nèi)環(huán)境紊亂、穩(wěn)定循環(huán)等處理外，結(jié)合本研究結(jié)論，應(yīng)用治療劑量的地塞米松進(jìn)行臟器保護(hù)也很有必要，值得作更進(jìn)一步的臨床觀察，為改善膿毒癥患者的預(yù)后作更多的努力。

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Effect of dexamethasone on expression of MD-2 genes and nuclear factor-κB in liver tissue at the early stage of LPS-induced rats.

LEI Xian-ying1,LI Yu-xin2,LEI Xian-rong3,GAN Ci-hai1,HU Li-rong1,XU Yu-ting1.1.Intensive Care Unit,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA;2.College of Nursing, Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA;3.Sterilization and Supply Room,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of dexamethasone on expression of myeloid differentiation protein-2(MD-2)genes and nuclear factor-κB(NF-κB)in liver tissue at the early stage of lipopolysaccharide(LPS)-induced rats.MethodsFifteen male SD rats were randomly divided into normal group,LPS group and treatment group(LPS+dexamethasone group),with 5 rats in each group.The rats were punctured catheter from tail vein to prepare for the administration.Normal group was injected with 10ml saline,LPS group was injected with LPS(10mg/kg) for more than 10min,and the treatment group was injected with LPS(10mg/kg,for more than 10min)and dexamethasone(0.1mg/kg).The rats were killed at 1 h after injection.The blood from the left ventricle was tested by biochemical detection for alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST).A part of the right lobe of liver tissue were extracted to store at-20℃in order to detect the expressions of MD-2 gene,and another part of the liver tissue were extracted to detect the level of NF-κB protein.Results(1)ALT and AST levels of the normal group were within the normal range,and the ALT and AST levels in LPS group were significantly increased.Compared with LPS group,the levels in treatment group were significantly decreased,with statistically significant difference between the two groups(P＜0.05).(2)The expressions of MD-2 gene and NF-κB protein were revealed low in the normal group,while the expressions in LPS group and treatment group were relatively high,showing statistically significant difference with the normal group(P＜0.05).The expressions in the treatment group were significantly decreased compared with LPS group(P＜0.05).ConclusionDexamethasone has significant clinical effects on acute liver injury at the early stage of LPS-induced rats.The mechanism may be associated with decreased expression level of MD-2 gene and NF-κB protein.

Lipopolysaccharide(LPS);Myeloid differentiation protein-2(MD-2);Nuclear factor-κB(NF-κB); Acute liver injury;Dexamethasone

R-332

A

1003—6350（2015）21—3121—03

2015-06-18)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1136

四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目[川教函(2008)760號：09027]；瀘州醫(yī)學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(編號：瀘醫(yī)院科[2009]1號-09008)

甘辭海。E-mail：ganyang130@sina.com