朱 健， 張志紅， 范菲菲， 趙麗華

(1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025; 2.貴州省土壤肥料研究所，貴州 貴陽(yáng)550006)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中使用的大量高銅殺菌劑、工業(yè)廢水、礦山排水等多種原因?qū)е滤w中銅污染日益加劇。銅作為植物生長(zhǎng)所必需的一種微量元素，人們對(duì)其營(yíng)養(yǎng)功能已有較為完整的認(rèn)識(shí)。但植物正常生長(zhǎng)所需要的銅量很少，當(dāng)過(guò)量銅被植物吸收后，會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育甚至死亡［1-2］。

海菜花屬于水鱉科，是中國(guó)特有三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)高原淡水植物，其生長(zhǎng)對(duì)水質(zhì)要求很高，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)具有重要的生態(tài)作用［3］。受水質(zhì)惡化的影響，中國(guó)海菜花的分布急劇減少，而重金屬對(duì)海菜花生理的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究模擬重金屬銅對(duì)海菜花生長(zhǎng)的生理影響，探討銅對(duì)海菜花的毒性機(jī)制，以期為保護(hù)和恢復(fù)海菜花提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試海菜花幼苗采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)花溪河平橋段。各分析純、生化純?cè)噭┒加贸兯渲啤?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采集的海菜花幼苗用自來(lái)水、超純水洗凈，1/10濃度Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液馴養(yǎng)7 d。在1/10 濃度Hoagland 培養(yǎng)液中加入CuSO4，使添加外源Cu2+濃度分別為: 0、0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的海菜花幼苗分別植入Cu2+溶液中進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)于溫度20 ℃，相對(duì)濕度80%，光照14 h/d 的恒溫溫室中進(jìn)行。每天添加適量的超純水補(bǔ)償損失水分，培養(yǎng)7 d 后測(cè)定相同葉齡葉片中葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性蛋白質(zhì)以及葉片中Cu2+含量以及超氧化物歧化酶( SOD) 、過(guò)氧化物酶( POD) 和過(guò)氧化氫酶( CAT) 活性。3 次重復(fù)。

1.3 分析方法

1.3.1 葉綠素、類胡蘿卜素含量測(cè)定 取處理幼苗相同葉齡相同部位葉0.5 g，以80%丙酮提取，用分光光度計(jì)測(cè)定663 nm、645 nm、470 nm 吸光度［4］。

1.3.2 SOD、POD、CAT 活性和可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定 取處理植株相同葉齡葉片，加入少量0.1 mol/L( pH=7.8) 的磷酸緩沖液，置冰浴研磨勻漿，離心(12 000 r/min，4 ℃，15 min) ，上清液用于酶活性與可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。SOD 活性測(cè)定采用NBT 光化還原法［4］，POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［4］，CAT 活性測(cè)定采用南京建成科技有限公司CAT 試劑盒測(cè)定。可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法［5］。

1.3.3 銅含量測(cè)定 將處理后的葉片自然風(fēng)干，研磨，取0.05 g 樣品加4 ml 硝酸、1 ml 高氯酸消解，1%硝酸定容至25 ml，電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定Cu2+含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，變化趨勢(shì)圖用origin7.0 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對(duì)海菜花幼苗葉片光合色素含量的影響

植物葉片光合色素含量與光合作用強(qiáng)度等因素密切相關(guān)，因此常用光合色素含量的高低來(lái)表征植物在逆境條件下受傷害的程度。由表1 可知，海菜花幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素隨著Cu2+處理濃度的增加而逐漸降低，且均與對(duì)照差異顯著( P ＜0.05) 。當(dāng)溶液中Cu2+處理濃度達(dá)到0.4 mg/L時(shí)，海菜花幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素分別比對(duì)照降低了36.7%、40.8%、37.9%、38.8%，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。說(shuō)明，高濃度的Cu2+降低了海菜花幼苗葉片中光合色素含量，減弱其光合作用強(qiáng)度，抑制海菜花幼苗的生長(zhǎng)。

表1 Cu2+脅迫對(duì)海菜花幼苗葉片光合色素含量的影響Table 1 The contents of photosynthetic pigment of Ottelia acuminata affected by different concentrations of Cu2+

2.2 銅脅迫對(duì)海菜花幼苗抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

SOD 是植物保護(hù)系統(tǒng)中重要的酶之一，在消除氧化物自由基和減輕膜傷害方面起著重要作用［6］。由表2 可以看出，海菜花幼苗葉片中SOD 活性隨Cu2+處理濃度的增加先升高后降低。在0.01 mg/L Cu2+處理時(shí)，SOD 活性最大，比對(duì)照提高74.8%，且與對(duì)照差異顯著，超過(guò)此濃度，SOD 活性開(kāi)始下降，在0.40 mg/L Cu2+處理時(shí)，達(dá)到最低，僅為對(duì)照組的16.7%，也與對(duì)照差異顯著。

經(jīng)Cu2+脅迫處理后，POD 活性的變化趨勢(shì)與SOD 一致，隨Cu2+處理濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。Cu2+濃度為0.01 mg/L時(shí)，POD 活性達(dá)最大值，比對(duì)照高46.1%;超過(guò)此濃度POD 活性開(kāi)始下降，在0.40 mg/L Cu2+時(shí)，為對(duì)照組的81.6%。

與Cu2+脅迫后SOD、POD 活性變化趨勢(shì)不同，Cu2+脅迫對(duì)葉片中的CAT 活性具有明顯的抑制效應(yīng)。海菜花葉中CAT 活性隨Cu2+處理濃度的升高而降低，各處理組均與對(duì)照組差異顯著( P ＜0.05) 。當(dāng)Cu2+處理濃度0.40 mg/L時(shí)，CAT 活性僅為對(duì)照組的58.0%。

表2 Cu2+對(duì)海菜花幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響Table 2 The activity of antioxidative enzyme of O. acuminata affected by different concentrations of Cu2+

2.3 銅脅迫對(duì)海菜花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝活動(dòng)的酶類，其含量是了解植物生理特征的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖1 可知，海菜花幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量隨Cu2+脅迫濃度的增大呈先增后降趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組，與對(duì)照差異顯著( P ＜0.05) 。Cu2+濃度0.10 mg/L處理的可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，比對(duì)照提高了85.3%。由此可見(jiàn)，銅脅迫處理后，海菜花幼苗葉片可能會(huì)產(chǎn)生某些抗性蛋白酶以抵御外界脅迫，減少Cu2+對(duì)植株的損傷。

2.4 銅脅迫對(duì)海菜花幼苗葉片富集銅的影響

圖1 Cu2+脅迫對(duì)海菜花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Protein contents affected by different concentrations of Cu2+

銅脅迫處理7 d 后，各處理組海菜花幼苗葉片中的Cu2+含量均高于對(duì)照組，且差異顯著( P ＜0.05) ( 圖2) 。Cu2+處理濃度0.20 mg/L時(shí)，海菜花幼苗葉片Cu2+含量達(dá)到最大值，為208.9mg/kg( 干質(zhì)量) ，其含量是對(duì)照的13.66 倍。當(dāng)Cu2+濃度為0.40 mg/L時(shí)，海菜花幼苗葉片中的Cu2+含量出現(xiàn)下降，但是葉片中的銅富集量較對(duì)照仍然很高，為對(duì)照的10.66 倍。

圖2 Cu2+脅迫對(duì)海菜花幼苗葉富集Cu2+的影響Fig.2 Cu2+ accumulation in Ottelia acuminata leaves

3 討論

植物葉片中的光合色素含量是反映植物光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，可以表征逆境脅迫因子對(duì)植物組織造成的影響［7-10］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2+脅迫顯著降低了海菜花幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，阻礙了葉綠素的合成，抑制海菜花幼苗的生長(zhǎng)，這與Cu2+脅迫對(duì)多花黑麥草葉綠素的影響規(guī)律一致［11］。其原因可能是: 首先，高含量Cu2+抑制了PSⅡ的電子傳遞過(guò)程，減弱了光合作用強(qiáng)度［12］，減少了葉綠素的合成;其次，Cu2+脅迫增加活性自由基的產(chǎn)生而氧化葉綠素，導(dǎo)致葉綠素含量的降低，最終引起光合速率的下降［13］;再次，可能是海菜花幼苗攝入過(guò)量的Cu2+與葉綠素合成的某些酶( 原葉綠素酸酯還原酶、膽色素原脫氨酶、8-氨基乙酰丙酸合成酶) 的-SH 結(jié)合，改變了酶的構(gòu)象，使酶失活，進(jìn)而造成光合色素含量的下降［14］。

SOD、POD 和CAT 共同組成植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，能有效地消除氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)固有的自由基代謝平衡［15］。隨著Cu2+處理濃度的增加，SOD 和POD 活性都是先上升后下降，這與Cu2+脅迫后三葉草、狗牙根、雙匯雀稗等葉片中SOD、POD酶活性變化規(guī)律一致［16］。而海菜花幼苗中CAT 活性與SOD、POD 酶活性變化規(guī)律不一樣，整體表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，低濃度Cu2+脅迫引起海菜花幼苗體內(nèi)自由基的增加，激活了海菜花幼苗體內(nèi)的SOD、POD 酶活性，而CAT 活性被抑制，歧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2不能有效的被CAT 清除，保護(hù)植物細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)失衡，致使海菜花幼苗生理代謝紊亂，加速其細(xì)胞的衰亡，對(duì)海菜花幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

在逆境條件下，植物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成會(huì)受到抑制，但會(huì)被誘導(dǎo)出一些新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生;但當(dāng)脅迫加重時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，蛋白質(zhì)合成受阻［17］。本研究中，低濃度Cu2+處理的海菜花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量升高主要是由于抗性蛋白的產(chǎn)生，高濃度Cu2+處理時(shí)，植物細(xì)胞受損，蛋白合成受阻，可溶性蛋白質(zhì)含量下降，這與孫天國(guó)等人的研究結(jié)果一致［17］。

本研究中，在0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.20 mg/L的Cu2+處理時(shí)，海菜花幼苗對(duì)Cu2+的富集量隨外源Cu2+濃度的增加而增大，當(dāng)Cu2+濃度大于0.20 mg/L時(shí)，由于海菜花幼苗的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，根的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低，使葉片中Cu2+含量降低，這與可溶性蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致。

［1］ 王婭玲，李維峰，馬巾媛，等.銅水平對(duì)咖啡幼苗若干生理代謝指標(biāo)的影響［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34(9) :6-8，13.

［2］ 韓春梅.銅脅迫對(duì)蘿卜幼苗根系生理生化指標(biāo)的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010 (1) :179-180.

［3］ 汪 松，解 焱.中國(guó)物種紅色名錄(1 卷) ［M］.北京: 高等教育出版社，2004:412.

［4］ 李合生.植物生理生化試驗(yàn)原理和技術(shù)［M］. 北京: 高等教育出版社，2000:134-136，164-169.

［5］ 張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.3 版. 北京: 高等教育出版社，2005:159-160.

［6］ 朱 健，龍 健，范菲菲.鹽酸左氧氟沙星脅迫對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)及生理特性的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41( 11) :17-21.

［7］ 張治平，於丙軍，汪良駒，等. 低溫下ALA 對(duì)番茄光合色素和抗氧化酶活性的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30( 1) :222-224.

［8］ 陳宏州，楊敬輝，張文文，等. 油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈抗性的生理應(yīng)答［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29( 3) :527-532.

［9］ 呂艷偉，何文慧，陳雨鷗，等. 鹽脅迫對(duì)小麥幼苗光合色素含量和細(xì)胞膜的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(6) :74-76.

［10］ 張麗娜，孫 海，李騰懿，等. Mn2+脅迫對(duì)西洋參生理特征及某些營(yíng)養(yǎng)元素吸收與分配的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(4) :192-196.

［11］ 劉大林，曹喜春，張 華.土壤Cu2+脅迫對(duì)多花黑麥草部分生理指標(biāo)的影響［J］.草地學(xué)報(bào)，2014，22(2) :319-325.

［12］ 田生科，李廷軒，楊肖娥，等.植物對(duì)銅的吸收運(yùn)輸及毒害機(jī)理研究進(jìn)展［J］.土壤通報(bào)，2006，37(2) :387-393.

［13］ 張麗娜，孫 海，李騰懿，等. Fe2+脅迫對(duì)西洋參某些生理指標(biāo)的影響［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26 (6) :2265-2270.

［14］ 王廣林，張金池，王 麗，等.銅鋅脅迫對(duì)丁香蓼生理指標(biāo)的影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，33(4) :43-47.

［15］ 李錚錚，伍鈞一，唐 亞，等. 鉛、鋅及其交互作用對(duì)魚(yú)腥草葉綠素含量及抗氧化酶系統(tǒng)的影響［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27(12) :5441-5446.

［16］ 余順慧，黃怡民，潘 杰，等.銅脅迫對(duì)2 種三峽庫(kù)區(qū)消落帶適生植物生長(zhǎng)及銅積累的影響［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27( 3) :1196-1200.

［17］ 孫天國(guó)，沙 偉，劉 巖. 復(fù)合重金屬脅迫對(duì)兩種蘚類植物生理特性的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30(9) :2332-2339.