浦雄勇，姚永良，孫王偉，蔣一彪，吳建紅

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 昆山 215300)

BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白受miR-421調(diào)控后的表達(dá)分析

浦雄勇，姚永良，孫王偉，蔣一彪，吳建紅

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 昆山 215300)

目的 研究miR-421在胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡過程中的分子機(jī)制。方法通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-421 mimics與miR-421 inhibitors轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞；Western blotting方法分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2以及細(xì)胞凋亡受體蛋白TNFR-Ⅰ、TNFR-Ⅱ的表達(dá)水平。結(jié)果miR-421 mimics與miR-421 inhibitors成功轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞；caspase-3、Bax蛋白在miR-421 inhibitors轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，而Bcl-2、TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ則表達(dá)降低。結(jié)論miR-421在BGC-823胃癌細(xì)胞中可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞表面凋亡受體蛋白TNFR的表達(dá)從而影響B(tài)GC-823的凋亡。

胃癌；miR-421；轉(zhuǎn)染

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼的小RNA，其堿基長度為20～22 bp，可通過堿基配對方式引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，最終調(diào)控蛋白的表達(dá)[1]。MiRNA在多種癌組織中均有一定程度的異常表達(dá)，并且這些miRNA直接或間接的影響著腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，以上提示miRNA可能發(fā)揮著類似原癌基因或抑癌基因的功能[2]。胃癌是人類常見的一種惡性腫瘤，目前眾多研究在胃癌中發(fā)現(xiàn)了大量的異常表達(dá)的miRNA，表明miRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。臨床研究表明miR-421在不同種類及不同分化類型的胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著升高，并且在胃癌早期即異常表達(dá)，提示其可能有助于早期胃癌的診斷。本研究通過miR-421在胃癌細(xì)胞BGC-823中的表達(dá)，探討其與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的作用及其對細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 BGC-823細(xì)胞系購自上海中科院細(xì)胞庫；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、小牛血清購自HyClone公司；ImagenFect RNAi轉(zhuǎn)染試劑盒購自無錫納奧生物醫(yī)藥有限公司；預(yù)染蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)marker、Cocktail蛋白酶抑制劑均購自Fermantas公司。Caspase-3、Bax、Bcl-2、TNFR-Ⅰ、TNFR-Ⅱ、GAPDH抗體購自武漢博士德生物科技有限公司。MiR-421 mimics、miR-421 inhibitors及miR-421陰性序列由上海吉瑪醫(yī)藥生物技術(shù)公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞于10%小牛血清，100 μg/μl青霉素-鏈霉素雙抗的EMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，飽和濕度環(huán)境中傳代培養(yǎng)，而轉(zhuǎn)染用的細(xì)胞培養(yǎng)基不添加青霉素-鏈霉素雙抗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 BGC-823胃癌細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞密集度達(dá)80%后，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗BGC-823細(xì)胞并加入500 μl OpitMEM培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)板孔中。同時將20 pmol的miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分別加入50 μl OpitMEM中；然后再分別加入含5 μl IR試劑的50 μl OpitMEM，微型振蕩器震蕩10 s，室溫靜置20 min，再加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。免疫熒光倒置顯微鏡下觀察miRNA的轉(zhuǎn)染效果。

1.4 Western blotting 收集各組經(jīng)miR-421 mimics、miR-421 inhibitors、negative miRNA轉(zhuǎn)染后的BGC-823胃癌細(xì)胞，PBS洗滌2次，1 000 r/min，離心5 min棄上清，加入100 μl預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上放置40 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min，Bradford方法測定蛋白濃度。取各處理組變性蛋白50 μl，于10%的SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，ECL作用后，X線膠片曝光成像，經(jīng)Image J軟件定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用Scheffe法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞 通過Imagen-Fect RNAi試劑盒將miR-421 mimics、miR-421 inhibitors、negative miRNA轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞24 h。免疫熒光倒置顯微鏡下觀察siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞效果(圖1)，大多數(shù)BGC-823細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明siRNA轉(zhuǎn)染成功且效率較高。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞結(jié)果

2.2 BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白分析 miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分別轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞24 h后，Western blotting分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax及Bcl-2的表達(dá)水平(圖2)，獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，Image J掃描其灰度并經(jīng)GAPDH灰度值校正后SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-421 mimics轉(zhuǎn)染BGC-823后，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)分別顯著下調(diào)1.23倍、1.45倍，而Bcl-2則表達(dá)顯著上調(diào)2.12倍，有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.833，P＜0.05)；miR-421 inhibitor轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后Caspase-3、Bax表達(dá)分別上調(diào)2.38倍、3.39倍，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)1.21倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.613，P＜0.05)。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對BGC-823細(xì)胞腫瘤壞死因子受體的影響 MiR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分別轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞24 h后，Western blotting分析細(xì)胞表面腫瘤壞死因子受體TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ的表達(dá)水平(圖3)，獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，Image J掃描其灰度并經(jīng)GAPDH灰度值校正后，SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-NA-421 mimics轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞后，TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ表達(dá)分別顯著上調(diào)1.11倍、2.32倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.301，P＜0.05)；而miRNA-421 inhibitors轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后TNF-Ⅰ與TNFR-Ⅱ表達(dá)則分別顯著減弱1.09倍、1.54倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.555，P＜0.05)。

圖2 Western blotting分析miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平

圖3 Western blotting分析miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negativemiRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后TNFR-I與TNFR-II的表達(dá)結(jié)果

3 討論

Caspase-3蛋白在細(xì)胞Fas/FasL信號系統(tǒng)中，可經(jīng)一系列激酶的作用而活化，或通過切割作用底物從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明Caspase-3在侵襲性胃癌細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度比原癌細(xì)胞高，其表達(dá)程度與腫瘤的惡性程度及分化程度密切相關(guān)[3]。MiRNA mimics是通過化學(xué)方法合成微小RNA，其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)可模擬細(xì)胞內(nèi)源miRNA從而增強(qiáng)內(nèi)源miRNA的功能；同樣miRNA inhibitors也是經(jīng)化學(xué)方法修飾過后具有抑制靶細(xì)胞miRNA的微小miRNA[4]。研究人員認(rèn)為腫瘤中的miRNA可能是癌基因的促進(jìn)因子，反之亦然。Caspase-3在胃癌細(xì)胞中的低表達(dá)可能與miR-421的過表達(dá)密切相關(guān)，本研究認(rèn)為miR-421可能抑制Caspase-3的表達(dá)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的無序增殖。

Bax和Bcl-2兩種蛋白在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用，然而多數(shù)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子均通過Caspase蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。本課題通過miR-421inhibitors、miR-421 mimics轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后，對Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BGC-823細(xì)胞中的miR-421可調(diào)控Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ在胃癌細(xì)胞中的陽性率明顯高于胃癌細(xì)胞鄰近的黏膜和正常黏膜組織，TNF-α/TNFR-Ⅰ信號在腫瘤微環(huán)境中的活化從而維持腫瘤細(xì)胞的未分化狀態(tài)，促進(jìn)胃癌的發(fā)展。本研究結(jié)果表明miRNA-421可增強(qiáng)TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ在BGC-823細(xì)胞的表達(dá)，但miRNA-421調(diào)控BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的具體機(jī)制仍需深入研究。

[1]Zeng Y,Wagner EJ,Cullen BR.Both natural and designed microRNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6):1327-1333.

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Expression analysis of related proteins in the apoptosis of BGC-823 gastric cancer cells regulated by miR-421.

PU Xiong-yong,YAO Yong-liang,SUN Wang-wei,JIANG Yi-biao,WU Jian-hong.Department of Clinical Laboratory, Kunshan People's Hospital Affiliated to Jiangsu University,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo study the molecular mechanism of miR-421 in the apoptosis of BGC-823 gastric cancer cells.MethodsmiR-421 mimics and miR-421 inhibitors were transfected into BGC-823 cells by siRNA transfection technology.The expression of proteins related to apoptosis or receptors such as caspase-3, Bax,Bcl-2,TNFR-Ⅰand TNFR-Ⅱwere detected by Western blotting.ResultsThe miR-421 mimics and miR-421 inhibitors were transfected into BGC-823 cells successfully.The expression of caspase-3 and Bax proteins were enhanced in BGC-823 cells transfected with miR-421 inhibitors,while the expression of Bcl-2,TNFR-Ⅰand TNFR-Ⅱwere decreased.ConclusionThe expression of apoptosis proteins caspase-3,Bax,Bcl-2 and cell surface receptor proteins TNFR are regulated by miRNA-421 to influence the apoptosis of BGCe-823 gastric cancer cells.

Gastric cancer;miR-421;Transfection

R735.2

A

1003—6350（2015）17—2500—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0907

2015-02-23)

昆山市科計劃項(xiàng)目（編號：KS1347）

吳健紅。E-mail:ejian7054@sohu.com