李永輝，譚銀豐，袁貴林，張俊清

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

益智不同提取物對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠縮尿作用的研究

李永輝1，2，譚銀豐1，2，袁貴林2，張俊清1，2

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

目的 研究益智7種提取物對(duì)大鼠水負(fù)荷多尿模型大鼠的縮尿作用，并探討分析益智縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用水負(fù)荷多尿模型大鼠，對(duì)益智7種提取物進(jìn)行縮尿活性篩選，采用代謝籠測(cè)定大鼠尿量、首次排尿時(shí)間，并計(jì)算2 h排泄率；ELISA測(cè)定大鼠血清中CRH的含量。結(jié)果益智醇提物組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹(shù)脂90%洗脫物組和圓柚酮組可以明顯的降低2 h大鼠尿量(P＜0.05)，延長(zhǎng)大鼠首次排尿時(shí)間(P＜0.05)，并能降低血清CRH的含量。結(jié)論益智的縮尿活性成分主要存在于益智果仁中，以圓柚酮為代表的倍半萜類成分可能是益智縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)。

益智；縮尿；活性成分；提取物

益智為姜科植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥果實(shí)，是姜科山姜屬的常用中藥材，具有溫脾止瀉攝唾，暖腎固精縮尿的功效，臨床上用于治療虛寒腹瀉、遺尿等多種疾病[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，益智具有抗炎[3]、抗過(guò)敏[4]、抗?jié)僛5]和神經(jīng)保護(hù)作用[6-8]等多種藥理作用。益智的化學(xué)成分研究表明，倍半萜、二苯基庚烷和黃酮是益智中的主要成分類別[9-10]。

益智的傳統(tǒng)應(yīng)用多“去殼”使用，如《理傷續(xù)斷方》記載“去殼炒”，《炮炙大法》“去殼炒，臨用研”?！侗静菝审堋贰叭と∪剩兴槿胨?，鹽煎?！?。清代《本草述鉤元》“去殼，或炒或煨，臨用研。而在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中益智多為全果使用，少見(jiàn)去殼后的益智仁。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)益智的果殼和果仁中化學(xué)成分差異較大，益智的倍半萜成分主要存在于益智果仁中，二苯基庚烷和黃酮類成分主要存在于益智果殼中[11]。因此在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們制備了7種益智提取物(成分)，運(yùn)用水負(fù)荷多尿模型大鼠對(duì)7種提取物(成分)的縮尿功效進(jìn)行了研究，以期揭示益智縮尿的物質(zhì)基礎(chǔ)，解釋益智傳統(tǒng)應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵，進(jìn)而為益智的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雄性，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2009-0012。

1.2 藥品與試劑 縮泉丸(湖南漢森制藥股份有限公司，批號(hào)130102)、益智藥材[產(chǎn)地海南瓊中，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院田建平副教授鑒定為姜科植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥成熟果實(shí)]、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRH)ELSIA試劑盒(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)C0607980317)。

1.3 制備方法 (1)益智揮發(fā)油：益智粉碎后加6倍量水，采用水蒸氣蒸餾的方法提取揮發(fā)油，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(2)益智醇提物：益智粉碎后加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取時(shí)間為1 h，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(3)益智果殼醇提物：益智粉碎后，以14目分樣篩篩選益智果殼，加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取時(shí)間為1 h，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(4)益智果仁醇提物：益智粉碎后，以14目分樣篩篩選益智果仁，加8倍量的95%乙醇，回流提取1次，提取時(shí)間為1 h，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度；(5)益智大孔樹(shù)脂乙醇洗脫物：益智粉碎后，以8倍量的95%乙醇回流提取1 h，提取液減壓回收至無(wú)醇味，以2倍量的50%乙醇溶解，上HP-20大孔吸附樹(shù)脂，上樣2次，先以5倍量的50%乙醇洗脫，減壓回收50%乙醇洗脫液至無(wú)醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度，得益智大孔樹(shù)脂50%乙醇洗脫物，繼續(xù)以5倍量的90%乙醇洗脫，減壓回收90%乙醇洗脫液至無(wú)醇味，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度，得益智大孔樹(shù)脂90%乙醇洗脫物；(6)圓柚酮：取圓柚酮化合物，以吐溫80配成相應(yīng)的給藥濃度。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物篩選 SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，仿Aston法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行篩選，即按照體重灌注去離子水22 ml/kg，使動(dòng)物體內(nèi)水平衡。收集2 h尿液，尿量超過(guò)40%水負(fù)荷者為合格。

1.4.2 分組與給藥 取篩選合格的大鼠80只，按尿量、體重均勻分為正常組、模型組、縮泉丸組、益智揮發(fā)油組、益智醇提取組、益智果殼醇提取組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹(shù)脂50%乙醇洗脫物組、益智90%乙醇洗脫物組、圓柚酮組，每組8只動(dòng)物。每組按5 ml/kg灌胃給藥10 d，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，分別于給藥前和末次給藥1 h后按25 ml/kg灌胃去離子水，正常組不給水負(fù)荷，擠盡膀胱余尿，置代謝籠中分別觀察給藥前和給藥后2 h尿量及首次排尿時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)束后，大鼠眼眶靜脈叢取血1 ml，分離血清，-80℃保存?？s泉丸給藥劑量為3.0 g/kg，益智各組給藥劑量為生藥7.5 g/kg，圓柚酮給藥劑量為60 ml/kg，相當(dāng)成人日服劑量的50倍。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，尿量的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，樣本組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)尿量的影響 與模型組比較，益智醇提取組、益智果仁醇提物組和圓柚酮組可以顯著降低大鼠2 h尿量，益智90%乙醇洗脫物組具有降低大鼠尿量的趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

表1 益智各提取物(成分)對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠尿量的影響(±s，n=8)

表1 益智各提取物(成分)對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠尿量的影響(±s，n=8)

注：與模型組比較，aP＜0.01，bP＜0.05。

正常組模型組縮泉丸組益智揮發(fā)油組益智醇提物組益智果殼醇提物組益智果仁醇提物組益智大孔樹(shù)脂50%洗脫物組益智大孔樹(shù)脂90%洗脫物組圓柚酮組----3.0 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 7.5 g/kg 60 mg/kg 0.92±0.68 4.85±1.04 3.92±0.93 5.21±1.13 3.15±0.86a5.05±1.02 3.47±0.83a4.35±1.32 3.48±1.12 3.28±1.06b19.18 -7.42 35.05 -4.12 28.45 10.31 28.25 32.37

2.2 益智各組(成分)對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠排尿的影響 與模型組相比，各給藥組對(duì)大鼠首次排尿時(shí)間均有一定的延長(zhǎng)，其中益智醇提物組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹(shù)脂90%洗脫物組和圓柚酮組對(duì)大鼠首次排尿時(shí)間影響較顯著(P＜0.05)。大鼠2 h平均尿量排泄率中，益智醇提物組、益智果仁醇提物組、益智大孔樹(shù)脂90%洗脫物組和圓柚酮組的排泄率均小于70%，顯示該4組對(duì)大鼠尿量均有較好的“縮尿”作用，見(jiàn)表2。

表2 益智各組（成分）對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠排尿的影響(±s，n=8)

表2 益智各組（成分）對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠排尿的影響(±s，n=8)

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 劑量 首次排尿 平均尿量時(shí)間(min)排泄率(%正常組-45.13±8.53-模型組-14.85±5.1597.00縮泉丸組3.0 g/kg37.46±9.16a78.40益智揮發(fā)油組7.5 g/kg16.32±6.17104.20益智醇提物組7.5 g/kg31.56±5.29a63.00益智果殼醇提物組7.5 g/kg19.62±8.16101.00益智果仁醇提物組7.5 g/kg35.18±6.27a69.40益智大孔樹(shù)脂50%洗脫物組7.5 g/kg20.43±6.2787.00益智大孔樹(shù)脂90%洗脫物組7.5 g/kg29.29±5.38a69.60圓柚酮組60 mg/kg26.78±8.12a65.60 )

2.3 益智各組對(duì)大鼠血清CRH含量的影響 益智各給藥組對(duì)血清中CRH均有一定降低趨勢(shì)，尤其是益智果仁醇提物組和益智醇提物組下降較明顯，但是由于整體影響較小，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 益智各組對(duì)大鼠血清CRH含量的影響(±s，n=8)

表3 益智各組對(duì)大鼠血清CRH含量的影響(±s，n=8)

組別 劑量CRH(ng/ml)正常組-7.39±0.28模型組-7.24±0.31縮泉丸組3.0 g/kg7.01±0.23益智揮發(fā)油組7.5 g/kg7.32±0.18益智醇提物組7.5 g/kg6.32±0.19益智果殼醇提物組7.5 g/kg6.98±0.16益智果仁醇提物組7.5 g/kg6.20±0.23益智大孔樹(shù)脂50%洗脫物組7.5 g/kg6.98±0.17益智大孔樹(shù)脂90%洗脫物組7.5 g/kg6.52±0.13圓柚酮組60 mg/kg6.34±0.25

3 討論

益智果實(shí)由果殼和果仁兩部分組成，在傳統(tǒng)應(yīng)用中多為“去殼”使用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，益智果殼中主要含有二苯基庚烷和黃酮類化合物，益智果仁中主要含有倍半萜類化合物，結(jié)合傳統(tǒng)的“去殼”使用，可以推測(cè)縮尿的活性物質(zhì)可能存在于益智果仁中，倍半萜可能是其主要活性成分。大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，益智果仁提取物的縮尿活性明顯優(yōu)于益智果殼提取物，驗(yàn)證了“益智縮尿的活性成分主要存在于益智果仁中”的假設(shè)。結(jié)合倍半萜的代表性成分圓柚酮的縮尿?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)圓柚酮可以明顯的減少大鼠2 h尿量。因此可以基本確定益智中倍半萜類化合物對(duì)縮尿功效有較大貢獻(xiàn)。

在進(jìn)行大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，不同大鼠的排尿尿量和排尿時(shí)間的個(gè)體差異較大，部分大鼠在2 h內(nèi)不產(chǎn)生排尿。因此在實(shí)驗(yàn)前首先要對(duì)大鼠進(jìn)行尿量篩選，選擇2 h尿量超過(guò)40%水負(fù)荷的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

促腎上腺皮質(zhì)激素生成激素是由下丘腦神經(jīng)元合成，垂體分泌的一種激素。Darcie等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠鞘內(nèi)注射20 μg或腹腔注射20 mg/kg的CRH，可以增加膀胱收縮頻率和降低膀胱，進(jìn)而產(chǎn)生遺尿。本文選擇了CRH作為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)益智各提取物的縮尿機(jī)制進(jìn)行了探討，其中益智醇提物組、益智果仁醇提物組和益智大孔樹(shù)脂洗脫90%洗脫物組呈現(xiàn)了較明顯的降低血漿CRH的作用，提示益智縮尿與CRH有一定關(guān)系。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:273.

[2]李文兵,胡昌江,吳珊珊,等.益智仁鹽炙對(duì)水負(fù)荷多尿模型大鼠縮尿作用的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(11):261-264.

[3 Chun KS,Kang JY,Kim OH,et al.Effects of yakuchinone A and yakuchinone B on the ester-induced expression of COX-2 and NO and activation of NF-kappa B in mouse skin[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol,2002,21(2):131-139.

[4]Shin TY,Won JH,Kim HM,et al.Effect ofAlpinia oxyphyllafruit extract on compound 48/80-induced anaphylactic reactions[J].Am J Chin Med,2001,29(2):293-302.

[5]Yamahara J,Li YH,Tamai Y.Anti-ulcer effect in rats of bitter cardamon constituents[J].Chem Pharm Bull,1990,38(11):3053-3054.

[6]Yu XY,An LJ,Wang YQ,et al.Neuroprotective effect ofAlpinia oxyphyllaMiq.fruits against glutamate-induced apoptosis in cortical neurons[J].Toxicol Lett,2003,144(2):205-212.

[7]Yu XY,WANG YW,Zhao H,et al.Neuroprotective effect ofAlpinia oxyphyllaextract against glutamate-induced apoptosis in cultured mouse cortical neurons[J].Neurosci Res Commun,2003,33(2): 105-103.

[8]黃 凌,朱 毅,董 志,等.益智仁揮發(fā)油急性毒性實(shí)驗(yàn)及對(duì)帕金森小鼠行為學(xué)和紋狀體多巴胺含量的影響[J].中藥材,2008,31 (5):722-726.

[9]羅秀珍,余競(jìng)光,徐麗珍,等.中藥益智化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2000,35(3):204-206.

[10]張啟鳳,羅仕德,王慧英,等.中藥益智仁化學(xué)成分的研究[J].中草藥,1997,28(3):131-132.

[11]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Different accumulation profiles of multiple components between pericarp and seed ofAlpinia oxyphyllacapsular fruit as determined by UFLC-MS/MS[J].Molecules, 2014,19(4):4510-4523.

[12]Kiddoo DA,Valentino RJ,Zderic S,et al.Impact of state of arousal and stress neuropeptides on urodynamic function in freely moving rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2006,290(6): 1697-1706.

Study on the urine reduction of seven extracts of Alpinia oxyphylla in water-loading diuresis model rats.

LI Yong-hui1,2,TAN Yin-feng1,2,YUAN Gui-lin2,ZHANG Jun-qing1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of Research and Development of Tropical Medicinal Plants,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of 7 kinds of extract ofAlpinia oxyphyllaon urine reduction of water-loading diuresis model rats,and to screen the urine reduction bioactive components ofAlpinia oxyphylla.MethodsUsing water-loading diuresis model rats,seven extracts ofAlpinia oxyphyllawere screened for their activity of urine reduction.The metabolism cage was used to determine the urine volume and the excretion time of rats.The 2 h excretion rate was calculated.The CRH content in rat serum was also determined by ELISA.ResultsThe ethanol extract ofA.oxyphylla,the ethanol extract ofA.oxyphyllaseed,the 90%ethanol elution of macroporous resin and nootkatone could significantly reduce the urine volume in 2 h(P＜0.05),prolong the first excretion time(P＜0.05), and decrease the contents of CRH in serum.ConclusionThe urine reduction bioactive components mainly exist inA.oxyphyllaseed,and the sesquiterpene compounds might be the material basis of urine reduction inA.oxyphylla.

Alpinia oxyphylla;Urine reduction;Bioactive components;Extrac

R-332

A

1003—6350（2015）08—1105—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0396

2014-10-09)

海南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：813196)；海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)(編號(hào)：ZDXM2014071)

張俊清。E-mail：jqzhang2011@163.com