薛萌，刁云輝，樊宏偉

（南陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科一病區(qū)，河南 南陽 473009）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，病灶內(nèi)癌細(xì)胞的遷移能力極強(qiáng)，容易在早期出現(xiàn)腫瘤病灶的浸潤，單純手術(shù)切除后的生存率較低[1,2]。食管癌的發(fā)生涉及多基因、多環(huán)節(jié)、多因素且未完全闡明。小 RNA （microRNA，miR） 是一類長度 18-22nt 并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的一類非編碼RNA，與靶基因 mRNA 的 3’非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’UTR）結(jié)合后阻礙 mRNA 的翻譯，最終實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制。在惡性腫瘤組織中，多種miRs 的表達(dá)存在異常，靶向原癌基因的miRs下調(diào)或靶向抑癌基因的miRs 上調(diào)均起到促癌作用[3-5]。miR-33b 是一類具有抑癌作用的miR，已經(jīng)在胃癌、 黑色素瘤等惡性腫瘤細(xì)胞中被證實(shí)能夠靶向高遷移率族蛋白A2 （high mobility group A2，HMGA2）基因并抑制細(xì)胞遷移[6,7]。但miR-33b 在食管癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制及HMGA2 是否受到miR-33b 的靶向調(diào)控尚不完全清楚。為此，本研究具體分析了miR-33b 靶向HMGA2 基因表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞遷移的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 食管癌Eca9706 細(xì)胞系購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自 Gibco 公司，陰性對照（NC）模擬物(序列：5’-GUUAUCAGUGACUAGCGUA-3’)、miR-33b 模擬物（序列：5’-GCUAGCAUGCUGAUGUCA-3’）、NC-siRNA（序列：5’-UGCAUGUACGC UAGCUAU-3’）、HMGA2-siRNA （序列：5’-UAGC UAGGCUAGCUAGUG-3’）、pcDNA3.0 空白質(zhì)粒、pcDNA3.0-HMGA2 質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司，雙熒光素酶報告基因（Psi-check2 質(zhì)粒）及檢測系統(tǒng)均購自Promega 公司，Lipofectamine2000 試劑購自Invitrogen 公司，Transwell 小室購自 Corning 公司，DIO 細(xì)胞膜綠色熒光染液購自上海碧云天公司，miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒、 培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒、石蠟包埋組織切片總RNA 提取試劑盒、FastKing 一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑購自北京天能公司，HMGA2單克隆抗體購自Abcam 公司。顯微鏡購自Nikon公司，熒光定量 PCR 儀購自 ABI 公司，GloMax 2020 單管型發(fā)光檢測儀為北京原平皓生物技術(shù)有限公司

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 Eca9706 細(xì)胞用含有10%FBS 的DMEM 貼壁培養(yǎng)，隔天進(jìn)行胰蛋白酶消化并按1:3 傳代。得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后接種在培養(yǎng)板內(nèi)并進(jìn)行分組、處理。NC 模擬物組轉(zhuǎn)染NC 模擬物，miR-33b 模擬物組轉(zhuǎn)染miR-33b 模擬物，NC-siRNA 組轉(zhuǎn)染 NC-siRNA，HMGA2-siRNA 組轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA，pcDNA3.0 組轉(zhuǎn)染 pcDNA3.0 空白質(zhì)粒，pcDNA3.0+miR-33 模擬物組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空白質(zhì)粒及miR-33b 模擬物，pcDNA3.0-HMGA2+miR-33b 模擬物組轉(zhuǎn)染 pcDNA3.0-HMGA2 質(zhì)粒及miR-33b 模擬物。轉(zhuǎn)染時，采用 Lipofectamine 2000 試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染、 按照試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染的操作，模擬物、siRNA 的終濃度均為50nmol/L，質(zhì)粒的終濃度為 1.2μg/ml。

1.3 細(xì)胞遷移的Transwell 檢測 Eca9706 細(xì)胞用無血清DMEM 重懸后接種在無基質(zhì)膠的transwell上層小室內(nèi)，下層小室內(nèi)加入600μl 含有10%FBS的DMEM，不同條件處理24h 后用磷酸鹽緩沖液漂洗小室3 遍，用棉簽擦去上層未侵襲的細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定過夜，第二天用DIO 細(xì)胞膜綠色熒光染液對細(xì)胞膜進(jìn)行染色并在顯微鏡下觀察，激發(fā)波長484nm、發(fā)射波從501nm，在5 個隨機(jī)高倍視野下對綠色熒光細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)、平均值即為侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.4 細(xì)胞遷移的劃痕檢測 Eca9706 細(xì)胞接種在6孔板中,用200μl 的移液頭在培養(yǎng)孔底部中央做一縱行劃痕并在顯微鏡下拍照記錄, 劃痕面積記為A0；不同條件處理24h 后，再次在顯微鏡下拍照記錄，劃痕面積記為 A24。按照公式（A0-A24）/A0 計(jì)算相對愈合面積。

1.5 熒光定量PCR Eca9706 細(xì)胞接種在12 孔板內(nèi)，不同條件處理24h 后用miRNA 提取試劑盒分離細(xì)胞中的miRNA 后用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒配置20μl 的PCR 反應(yīng)體系，miR-33b 的 上游引 物 為 5’-CGAUCGU ACGACUACAGU-3’、 下游引物為試劑盒內(nèi)的通用引物, 按照程序 95℃ 15s、60℃ 1min 反應(yīng) 40 個循環(huán),根據(jù)循環(huán)曲線計(jì)算miR-33b 的表達(dá)量； 另取E-ca9706 細(xì)胞，不同條件處理24h 后用培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒分離RNA、用FastKing 一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Talent 熒光定量檢測試劑盒配置 20μl 的 PCR 反應(yīng)體系，HMGA2 的上游引物為5’-TAAGCTAGTAGCTAGCTA-3’、下游引物為 5’-ATTCGATGCTAGCTACGA-3’，按照程序 95 ℃15s、60℃ 1min 反應(yīng)40 個循環(huán)，根據(jù)循環(huán)曲線計(jì)算HMGA2 的 mRNA 表達(dá)量。

1.6 Western blot Eca9706 細(xì)胞接種在12 孔板內(nèi)，不同條件處理24 小時后用蛋白裂解液提取總蛋白,用BCA 試劑盒測定蛋白濃度后取30μg 蛋白與上樣緩沖液混合,加入預(yù)先配置好的聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，80V 電壓電泳至分離膠和濃縮膠交界處，調(diào)整至110V 電壓、電泳至指示條帶接近分離膠下緣，停止電泳后300mA 轉(zhuǎn)膜80min，將NC膜放入5%脫脂牛奶封閉2h，加入HMGA2 第一抗體、4℃孵育過夜。第二天，TBST 洗膜3 遍后加入第二抗體、 室溫孵育2h，TBST 洗膜3 遍后加入顯影液、在化學(xué)顯影儀中曝光得到蛋白條帶，分析灰度值并根據(jù)HMGA2 灰度值與β-actin 灰度值的比值計(jì)算表達(dá)量。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測 構(gòu)建包含HMGA2 mRNA 3’UTR 序列的雙熒光素酶報告基因,將雙熒光素酶報告基因與NC 模擬物或miR-33b 模擬物共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入Eca9706 細(xì)胞，48 小時后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒在GloMax 2020 單管型發(fā)光檢測儀上測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值, 以螢火蟲熒光值/海腎熒光值計(jì)算熒光素酶報告基因的熒光活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，兩組間計(jì)量資料的比較采用t 檢驗(yàn)、三組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-33b 模擬物對Eca9706 細(xì)胞遷移的影響與NC 模擬物組比較，miR-33b 模擬物組細(xì)胞中miR-33b 的表達(dá)量明顯增多 (P＜0.05), 見圖1A；transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，與NC 模擬物組比較，miR-33b模擬物組細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯減少(P＜0.05),見圖1B；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,與NC 模擬物組比較,miR-33b模擬物組細(xì)胞的相對愈合面積明顯減少 (P＜0.05）,見圖1C。

圖1 miR-33b模擬物對Eca9706 細(xì)胞遷移的影響

2.2 miR-33b 模擬物對 Eca9706 細(xì)胞中 HMGA2的靶向調(diào)控作用 經(jīng)TargetScan 網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，miR-33b 能夠靶向結(jié)合HMGA2 mRNA的 3’UTR,見圖2A；經(jīng) western blot 檢測，與 NC 模擬物組比較，miR-33b 模擬物組細(xì)胞中HMGA2 的蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）,見圖2B；經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測,與NC 模擬物組比較，miR-33b模擬物組細(xì)胞的熒光活力明顯降低（P＜0.05）,見圖2C。

2.3 沉默HMGA2 對Eca9706 細(xì)胞遷移的影響 與NC-siRNA 組比較，HMGA2-siRNA 組細(xì)胞中 HMGA2 的表達(dá)明顯減少(P＜0.05),見圖3A-B;transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與 NC-siRNA 組比較,HMGA2-siRNA 組細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯減少（P＜0.05）,見圖3C；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,與 NC-siRNA 組比較,HMGA2-siRNA 組細(xì)胞的相對愈合面積明顯減少(P＜0.05),見圖3D。

圖2 miR-33b模擬物對Eca9706 細(xì)胞中HMGA2 的靶向調(diào)控作用

圖3 沉默HMGA2 對Eca9706 細(xì)胞遷移的影響

2.4 過表達(dá) HMGA2 對 miR-33b 調(diào)控 Eca9706 細(xì)胞遷移的影響 與pcDNA3.0 組比較、pcDNA3.0+miR-33 模擬物組Eca9706 細(xì)胞中HMGA2 的表達(dá)量明顯減少（P＜0.05），與 pcDNA3.0+miR-33 模擬物組比較、pcDNA3.0-HMGA2+miR-33 模擬物組細(xì)胞中 HMGA2 的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）,見圖4A。

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與 pcDNA3.0 組比較、pcDNA3.0+miR-33b 模擬物組Eca9706 細(xì)胞的相對愈合面積明顯減少（P＜0.05），與 pcDNA3.0+miR-33b模擬物組比較、pcDNA3.0-HMGA2+miR-33b 模擬物組細(xì)胞的相對愈合面積明顯增加（P＜0.05）,見圖4B。

Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，與 pcDNA3.0 組比較、pcDNA3.0+miR-33b 模擬物組Eca9706 細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯減少（P＜0.05），與 pcDNA3.0+miR-33b模擬物組比較、pcDNA3.0-HMGA2+miR-33b 模擬物組細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯增加（P＜0.05）,見圖4C。

圖4 過表達(dá)HMGA2 對miR-33b調(diào)控Eca9706 細(xì)胞遷移的影響

3 討論

食管癌的發(fā)病機(jī)制至今仍未明確,臨床上也缺乏治療食管癌的靶向藥物。近年來，miR 被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，其中miR-33b 是一種具有抑癌特性的miR，已經(jīng)被證實(shí)在食管癌、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)趨勢[8-10]。相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-33b對多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均具有抑制作用且其抑制遷移的作用與靶向抑制HMGA2的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以食管癌Eca9706 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，通過轉(zhuǎn)染miR-33b 的方式來增加細(xì)胞中miR-33b 的表達(dá),在轉(zhuǎn)染miR-33b 模擬物后觀察到細(xì)胞中miR-33b 的表達(dá)明顯增多且細(xì)胞在Transwell 及劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移明顯受到抑制，說明miR-33b 對食管癌細(xì)胞的遷移具有抑制作用。

在胃癌和黑色素瘤中，miR-33b 被證實(shí)能夠靶向抑制HMGA2 基因的表達(dá)，該基因的編碼產(chǎn)物是一種非組蛋白的染色體構(gòu)架蛋白，通過“AT-鉤”的結(jié)構(gòu)來與DNA 中富含AT 的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)作用。HMGA2 在食管癌、肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)趨勢[11-14]且多項(xiàng)離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，沉默HMGA2 能夠抑制胃腸道惡性腫瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的遷移[15-17]。在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA使食管癌Eca9706 細(xì)胞中HMGA2 的表達(dá)發(fā)生下調(diào)后，細(xì)胞在Transwell 及劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移也明顯受到抑制，說明HMGA2 參與食管癌細(xì)胞遷移的調(diào)控、HMGA2 表達(dá)的下調(diào)能夠使食管癌細(xì)胞的遷移受到抑制，結(jié)合miR-33b 在其他細(xì)胞中對HMGA2 的靶向抑制作用及HMGA2 在食管癌遷移中的作用推測：miR-33b 對食管癌細(xì)胞遷移的抑制作用可能與其靶向調(diào)節(jié)HMGA2 表達(dá)有關(guān)。

為了驗(yàn)證這一推測，本實(shí)驗(yàn)首先分析了miR-33b 對食管癌細(xì)胞中HMGA2 的靶向作用。MiRs 發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是與靶基因mRNA 的3’UTR以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合并阻礙mRNA 的翻譯、抑制基因的表達(dá)。在Targetscan 中進(jìn)行生物信息 學(xué) 分 析 可 知 ，HMGA2 mRNA 的 3’UTR 上 有miR-33b 的結(jié)合位點(diǎn);將 HMGA2 mRNA 的 3’UTR裝載進(jìn)入雙熒光素酶報告基因后，miR-33b 能夠使相應(yīng)雙熒光素酶報告基因的熒光值降低, 說明miR-33b 能夠在食管癌細(xì)胞中靶向結(jié)合HMGA2 mRNA 的 3’UTR、對 HMGA2 基因表達(dá)具有靶向調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計(jì)了HMGA2 的過表達(dá)質(zhì)粒，通過過表達(dá)HMGA2 的方式來進(jìn)一步驗(yàn)證miR-33b 通過靶向HMGA2 調(diào)控食管癌的遷移，結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染pcDNA3.0 空白質(zhì)粒時，miR-33b 模擬物能夠顯著抑制食管癌細(xì)胞的遷移；而在轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-HMGA2 治療使HMGA2 表達(dá)增加時，miR-33b 模擬物抑制食管癌遷移的作用發(fā)生了明顯逆轉(zhuǎn)，由此證實(shí)miR-33b 通過靶向抑制HMGA2 的表達(dá)來抑制食管癌細(xì)胞的遷移。

綜上所述，miR-33b 能夠直接靶向HMGA2 基因的表達(dá)并抑制食管癌Eca9706 細(xì)胞的遷移，未來miR-33b 可能成為食管癌治療的新靶點(diǎn)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。