魏均強，蔡 谞，陶 笙，張 莉，趙 斌，汪嬡媛

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院骨科，海南 三亞 572013；2.中國人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853）

中空多孔鈦假體復(fù)合松質(zhì)骨基質(zhì)兔體內(nèi)骨生成組織學研究

魏均強1，蔡 谞2，陶 笙1，張 莉2，趙 斌2，汪嬡媛2

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院骨科，海南 三亞 572013；2.中國人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853）

目的 利用復(fù)合松質(zhì)骨基質(zhì)(Cancellous bone matrix，CBM)的中空多孔鈦假體(Hollow porous titanium prostheses,HPTP)觀察兔體內(nèi)假體周圍及內(nèi)部骨生成情況，探討人工假體與骨質(zhì)整合的改進方法。方法設(shè)計中空多孔(孔徑2 mm)和無孔兩種假體，表面行羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)噴涂。實驗組分為無孔假體組(A組)、HPTP組(B組)和HPTP＋CBM組(C組)，每組16例。將假體分別植入48只4～6個月齡新西蘭大白兔右側(cè)股骨外側(cè)髁，飼養(yǎng)至第3、8、12周時取材，以X線、顯微鏡、電鏡及形態(tài)計量軟件觀察復(fù)合假體表面及內(nèi)部骨生成情況。采用SPSS13.0進行t檢驗分析。結(jié)果三組植入物外表面HA涂層的組織生長情況類似；A組無孔，未見骨長入，B組和C組中骨組織最終可長入假體2 mm大的圓孔；各時間點C組中空腔內(nèi)骨生長率均明顯高于B組(P＜0.01)。結(jié)論骨質(zhì)可經(jīng)HPTP假體孔洞長入腔內(nèi)，達到交鎖固定，較無孔假體更穩(wěn)定；中空腔復(fù)合CBM后可明顯加快骨長入并誘導(dǎo)骨生成，使假體與骨質(zhì)更好整合。

中空多孔；假體；骨生成；骨基質(zhì)；組織學

人工關(guān)節(jié)置換已被證明是一種修復(fù)嚴重關(guān)節(jié)疾患的成熟技術(shù)，但遠期仍存在假體壽命有限、骨溶解和無菌性松動等問題，患者面臨翻修風險[1-2]。如何改進假體設(shè)計，仍是很有研究價值的課題。蔡谞率先提出了生物復(fù)合型中空多孔關(guān)節(jié)假體的設(shè)計構(gòu)想，其理念是將假體與骨質(zhì)接觸部分設(shè)計為空心體，并利用復(fù)合于其中的骨誘導(dǎo)材料誘導(dǎo)周圍骨質(zhì)通過孔洞長入假體腔，達到更好的骨整合效果[3-4]。本研究擬分別將復(fù)合或不復(fù)合松質(zhì)骨基質(zhì)(Cancellous bone matrix，CBM)的中空多孔鈦假體(Hollow porous titanium prostheses,HPTP)和無孔假體植入兔股骨髁內(nèi)，定期取材，觀察兔體內(nèi)假體和CBM周圍及內(nèi)部骨生成可能性及組織學變化，以探討人工假體與骨質(zhì)整合的改進方法。

1 材料與方法

1.1 假體及松質(zhì)骨基質(zhì)的制備 32個HPTP假體和16個無孔假體均采用TC4鈦合金棒材制作(圖1A)。HPTP假體植入骨內(nèi)部分為空心圓桶狀，高8.5 mm，外徑7 mm，內(nèi)徑6 mm，側(cè)壁和底壁厚度均為0.5 mm，側(cè)壁3排圓孔，每排6個，底壁圓孔有4個，共22個。實心假體制作規(guī)格同上，區(qū)別為側(cè)壁與底壁無孔(圖1A)。假體植入骨內(nèi)的部分行HA等離子噴涂。6粒CBM由新鮮小牛松質(zhì)骨制成。將長7.5 mm，直徑5.5 mm的圓柱形骨柱進行去抗原處理，形成三維網(wǎng)孔狀材料并分裝(圖1B)。所有假體和CBM均行環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和動物手術(shù) 將實驗植入材料分為無孔假體組(A組)、HPTP組(B組)和HPTP＋CBM組(C組，CBM被置入HPTP中空腔內(nèi))三組，每組16例。取48只4～6個月齡健康新西蘭大白兔，體重2.5～3 kg，雌雄不限，將各植入體隨機植入兔的右側(cè)股骨外側(cè)髁(圖1C、圖1D)。

1.2.2 標本的采取與制備 觀察時間點為植入后3周、8周、12周，實驗兔處死前第13天和第3天兩次行四環(huán)素熒光標記，按50 mg/kg進行肌注，處死前行X線檢查。標本截斷面在髁上1 cm。每時間點每組各取五個標本用于不脫鈣骨切片的觀察，另取一個第12周的標本進行掃描電鏡觀察。

1.2.3 制作不脫鈣骨切片 用不同濃度的酒精對標本逐級脫水，常溫下將標本聚合包埋。骨標本用Leica 1600金剛砂不脫鈣切片機進行連續(xù)切片，厚度為50 μm，行Giemsa染色并制作切片。采用Olympus BX51型生物顯微鏡和DP70圖像采集系統(tǒng)進行觀察。

1.2.4 制作電鏡標本 將標本的界面組織分割成小塊，制作電鏡標本，用HITACHI S-4800型掃描電子顯微鏡觀察。另對CBM的孔隙結(jié)構(gòu)亦進行噴金鍍膜及電鏡觀察。

1.2.5 骨形態(tài)計量學分析 B、C組每標本各取一片不脫鈣骨組織切片，經(jīng)計算機圖像采集系統(tǒng)采集包括假體的整體圖像，用Image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)判斷并計算中空腔內(nèi)新生骨組織面積，算出新生骨形成率(新生骨形成率=新生骨組織面積/假體中空腔內(nèi)部總面積×100%)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，B、C組標本不同時間點的平均結(jié)果均以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間新生骨形成率兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 整體觀察和X線表現(xiàn) 取材時可見植入體與股骨髁骨質(zhì)結(jié)合緊密，其周圍骨質(zhì)略增厚。術(shù)后3、8、12周X線提示：假體位置良好，無骨折。A組各時間點無明顯變化，B、C組可見原假體孔洞部位骨質(zhì)密度隨時間延長增加，顯影模糊。第12周時，B組螺帽下可見一層很薄的類骨樣組織，其下中空腔內(nèi)仍為纖維肉芽組織充填；C組內(nèi)部已有骨狀物存在，與假體內(nèi)壁緊密相連，質(zhì)地較堅硬(圖2)。

2.2 光學顯微鏡觀察 ①術(shù)后3周：各組假體表面有大量成骨細胞浸潤，少量纖維組織和新生血管包繞，局部仍有血腫，并有少許新骨形成(圖3A)。B組假體部分孔洞處可見有新生類骨質(zhì)長入。C組原有CBM的結(jié)構(gòu)仍清晰可見，無明顯吸收，CBM周圍及內(nèi)部可見大量新生類骨質(zhì)形成，有大量成骨細胞(圖3B、圖3C)。②術(shù)后8周：各組假體周圍新生纖維組織明顯減少，新生骨組織相對增加(圖3D)。B組假體壁孔洞處可見更多新生骨形成，內(nèi)部中空腔內(nèi)纖維肉芽組織與術(shù)后3周相比無明顯變化(圖3E)。C組孔洞處新生骨明顯，中空腔內(nèi)原CBM結(jié)構(gòu)部分被吸收，為新生骨小梁或類骨質(zhì)所爬行替代(圖3F)。③術(shù)后12周：各組假體表面有大量的新生骨形成，可見完整的骨小梁和哈佛氏管系統(tǒng)，骨-假體結(jié)合緊密。B組中空腔內(nèi)機化的纖維組織較多，有少量稀疏的骨小梁組織，部分孔洞處見較多新生骨形成，與假體外骨組織相連，將假體中空腔封閉(圖3G)。C組中空腔和孔洞處新生骨組織進一步增多，以成熟的骨小梁為主，纖維肉芽組織已明顯減少，內(nèi)部CBM大部分已被吸收(圖3H、圖3I)。

2.3 電鏡觀察 圖4A可見CBM松質(zhì)骨小梁內(nèi)大量的三維網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)。圖4B為假體表面HA涂層外生成的骨質(zhì)形態(tài)，越靠近HA新生骨小梁越致密，骨小梁間隙內(nèi)可見散在的骨細胞，在各組假體周圍均無明顯區(qū)別。圖4C為HPTP組長入假體孔洞內(nèi)的骨組織，可見骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面為膜狀纖維和基質(zhì)覆蓋。圖4D則提示HPTP假體內(nèi)加載CBM后，其內(nèi)生成的組織雖然混雜有部分纖維成分，但骨小梁結(jié)構(gòu)和骨細胞存在，提示有骨樣組織形成。

2.4 中空腔內(nèi)骨形態(tài)計量學分析 對B、C組各時間點假體內(nèi)的新生骨形成率進行t檢驗，P值均＜0.01，提示B、C組中空腔內(nèi)部新生骨量比較差異有顯著統(tǒng)計學意義，C組中空腔內(nèi)骨生長率要明顯高于B組，見表1。

圖1 實驗材料的植入

圖2 C組和B組12周時標本外觀

表1 各時間段B、C組植入體新生骨形成率(%，±s)

表1 各時間段B、C組植入體新生骨形成率(%，±s)

組別B組C組t值P值3周5.1±1.4 27.5±2.7 -16.5＜0.01 8周6.6±2.0 41.3±3.2 -20.6＜0.01 12周7.0±1.3 57.6±4.1 -26.3＜0.01

圖3 術(shù)后不同時間點各組的光學顯微觀察結(jié)果

圖4 電鏡下CBM的微孔結(jié)構(gòu)和假體周圍新生骨結(jié)構(gòu)

3 討 論

如何提高假體表面骨長入，增加假體與周圍骨床的結(jié)合力和范圍，從而獲得長期穩(wěn)定，仍然是生物固定型假體不斷改進的研究焦點。受骨收集室(Bone harvest chamber，BHC)[5]及椎間融合器等啟發(fā)，有學者等提出中空多孔金屬假體的設(shè)計構(gòu)想，并進行了大量研究，取得了初步的肯定結(jié)果[3-4，6]。本實驗在繼續(xù)觀察中空多孔假體骨-假體界面成骨效應(yīng)的同時，進一步對中空多孔假體腔內(nèi)成骨性能進行了對比研究，探討CBM等骨誘導(dǎo)物質(zhì)對HPTP假體腔內(nèi)成骨的影響，試圖為該設(shè)計應(yīng)用于臨床進一步奠定實驗和理論基礎(chǔ)。

生物固定型人工關(guān)節(jié)假體的穩(wěn)定性除了依靠其幾何形狀達到初始穩(wěn)定外，假體-骨界面的緊密結(jié)合對遠期穩(wěn)定至關(guān)重要[7]。對于后者，目前相關(guān)研究主要集中在假體材料選擇及表面處理兩個方面。在材料學短期內(nèi)難以取得突破的情況下，新的假體表面處理方法不斷涌現(xiàn)，如珍珠面、鈦絲面、噴砂面、羥基磷灰石面等，特別是HA噴涂技術(shù)已被證明確實有利于假體與周圍骨質(zhì)更緊密地結(jié)合[8]。但總體上看，這些經(jīng)過處理的假體與骨結(jié)合范圍、深度和強度仍相當有限，骨結(jié)合率僅6%～35%[9]，只有少量的骨質(zhì)長入假體表面，而且長入的骨質(zhì)類似于盲端結(jié)構(gòu)，相互交聯(lián)少，骨代謝空間小，承受應(yīng)力大且集中，對假體遠期穩(wěn)定性的幫助并不一定理想。本實驗在既往研究的基礎(chǔ)上進一步表明，設(shè)計為中空的假體除了假體-骨界面可以達到牢固結(jié)合外，骨質(zhì)可經(jīng)孔洞長入假體腔內(nèi)，從而實現(xiàn)比表面嵌合更為牢固的假體-骨結(jié)合，為解決人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的松動問題提供了新的思路。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使不添加成骨影響因子，界面骨質(zhì)也可通過孔洞長入金屬空腔體內(nèi)并形成成熟的骨小梁。但要使通過孔洞長入假體腔內(nèi)的骨再生最大化，合理的孔徑大小與恰當?shù)恼T導(dǎo)應(yīng)該是必要條件。目前，關(guān)于生物固定型假體多孔表面孔隙的最佳大小及密度尚無定論，有的學者認為孔隙在100～400 μm時較適合骨組織長入。本實驗在綜合參考以往實驗效果的基礎(chǔ)上，將孔洞大小定為2 mm，最終仍取得了較好的腔內(nèi)成骨效果。良好的細胞支架已被證明可有效促進骨再生[10]。CBM具有良好的生物相容性和支撐強度。本實驗將CBM置入HPTP中空腔內(nèi)，試圖誘導(dǎo)成骨細胞沿松質(zhì)骨基質(zhì)攀爬，從而有利于界面骨質(zhì)經(jīng)孔洞長入假體腔室內(nèi)。結(jié)果證實，復(fù)合三維網(wǎng)狀松質(zhì)骨確實比單純植入HPTP假體更有利于腔內(nèi)成骨，從而更有利于假體與周圍骨質(zhì)的交鎖結(jié)合。

中空多孔金屬假體作為一種新的人工關(guān)節(jié)假體設(shè)計理念，嘗試使假體與周圍骨質(zhì)形成前所未有的“一體化結(jié)合”，具有較高的可行性。在HPTP假體腔內(nèi)復(fù)合骨誘導(dǎo)物質(zhì)后，其腔內(nèi)成骨效果更為明顯。然而，如何將本研究結(jié)果應(yīng)用于臨床尚需進行進一步研究。

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Histological study of bone growth in hollow porous titanium prostheses loading cancellous bone matrix in vivo of rabbits.

WEI Jun-qiang1,CAI Xu2,TAO Sheng1,ZHANG Li2,ZHAO Bin2,WANG Ai-yuan2.1.Department of Orthopedics,Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital,Sanya 572013,Hainan,CHINA;2.Department of Orthopedics,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

Objective To observe the possibility of bone formation in vivo of rabbits with hollow porous titanium prostheses(HPTP)loading cancellous bone matrix(CBM),so as to improve the osteointegration between prostheses and bone.MethodsHPTP(2 mm in diameter)and non-porous prostheses coated with HA were designed.Experimental samples were divided into non-porous prosthesis group(group A),HPTP group(group B)and HPTP plus CBM group(group C),with 16 samples in each group.All the implants were implanted in the right lateral femoral condyles of 48 New Zealand rabbits of 4～6 months old,which were fed to 3,8,12 weeks later and sacrificed.SPSS13.0 software was used fort-test analysis.ResultsThe tissues around HA-coated implants in the three groups were nearly the same at different time points.No bone grew into Group A because of non-porous design,and bone could grow into the 2 mm round holes both in group B and C ultimately.Bone formation rates in group C were significantly higher than that in group B at different time points(P＜0.01).ConclusionBone could grow into the cavity of HPTP prostheses via the round holes to achieve locking fixation effect,which are more stable than non-porous prostheses. CBM could speed up bone ingrowth significantly and induce bone formation to achieve better integration of prostheses and bone.

Hollow porous;Prosthesis;Bone ingrowth;Bone matrix;Histological

R-332

A

1003—6350（2015）08—1097—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0394

2014-10-30)

國家自然科學基金（編號：30471755）

蔡 谞E-mail:476511077@qq.com