吳楊平　陳愛華　張　雨　姚國興　張志偉　蔡永祥

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所　南通　226007)

雜交是創(chuàng)造變異的重要途徑, 是動植物遺傳改良的重要手段, 其主要作用是利用雜種優(yōu)勢為育種制備中間材料(張國范等, 2004)。一個世紀(jì)以來, 雜種優(yōu)勢一直是學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點之一, 主要原因在于其對生物產(chǎn)生的巨大作用、輔助的生物學(xué)機制及應(yīng)用前景(張國范等, 2009)。采用雜交育種技術(shù), 進(jìn)而利用雜種優(yōu)勢, 在動植物育種中已取得廣泛成功。海洋經(jīng)濟(jì)貝類種類繁多, 是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最多的類群(約占70%)(李加琦, 2011)。在自然狀態(tài)下, 貝類的活動范圍較小, 因而比較容易形成具有不同遺傳特色的群體。因此, 貝類種內(nèi)、種間雜交的研究較多。而隨著研究的不斷深入和擴(kuò)大, 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)種間雜交由于親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn), 經(jīng)常會出現(xiàn)雜交不親和、幼體不成活、雜種 F1不育、育性差和“瘋狂分離”等現(xiàn)象(張國范等, 2009)。盡管國內(nèi)外對一些貝類研究過種間雜交, 但目前僅雜交蚌(李家樂等, 2007)等極少數(shù)種類成功應(yīng)用; 而種內(nèi)雜交卻不存在配子間的親和、發(fā)育障礙和育性等問題。因此, 自20世紀(jì)70年代以來, 貝類種內(nèi)雜交的研究逐漸增多, 并且取得了較大進(jìn)展(Newkirket al, 1977; Manziet al, 1991; Cruzet al, 1997; 張國范等, 2002; 常亞青等, 2002; 游偉偉等, 2010)。

文蛤(Meretrix meretrix)素有“天下第一鮮”之美譽,廣泛分布于我國各海區(qū), 遼寧遼河口、山東萊州灣、江蘇南部沿海及廣西北部灣等資源最為豐富, 形成了我國文蛤的主產(chǎn)區(qū)。文蛤養(yǎng)殖歷史悠久, 其養(yǎng)殖方式逐漸由過去單一的自生自長、自然采捕的原始狀態(tài)發(fā)展成如今的移苗增殖、灘涂蓄水暫養(yǎng)、圍網(wǎng)精養(yǎng)、池塘混養(yǎng)等多種養(yǎng)殖方法, 但是不管養(yǎng)殖方式有多大的改變, 缺少高產(chǎn)抗逆品種一直掣肘著文蛤產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為此, 積極開展文蛤系統(tǒng)育種工作, 為產(chǎn)業(yè)發(fā)展注入新的活力是非常必要的。鑒于此, 本研究開展了不同文蛤地理群體間紅殼個體的雙列雜交, 旨在為文蛤雜交育種及雜種優(yōu)勢在生產(chǎn)中的利用提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　親貝來源與3×3雙列雜交試驗設(shè)計

親貝分別采自江蘇如東(S)、廣西北海(G)和日本本州(J)。在位于呂四港的江蘇省海洋經(jīng)濟(jì)貝類研發(fā)中心的試驗基地暫養(yǎng)促熟后用于家系構(gòu)建。2013年 8月6—8日, 采用完全雙列雜交方式構(gòu)建選育家系(見表1), 共成功構(gòu)建 6組(Gg、Gs、Gj、Sg、Ss、Sj), 每組3個平行家系, 每個家系均由不同的1雌1雄文蛤配對繁殖產(chǎn)生。

表1　文蛤3×3雙列雜交試驗設(shè)計Tab.1　Design of diallel cross for Meretrix meretrix

1.2　雜交家系的構(gòu)建及培育

采用陰干和流水刺激方法分別處理江蘇如東、廣西北海及日本本州文蛤群體中的紅殼個體, 親貝陰干12h后經(jīng)流水刺激1h, 為防止意外受精, 將單個文蛤放入1L的燒杯中產(chǎn)卵和排精。分別收集卵子和精液后按照雙列雜交設(shè)計構(gòu)建表1各組家系。

1.3　幼蟲及稚貝培育

將上述建立的各家系組轉(zhuǎn)移至300L的圓柱形塑料白缸中培育。經(jīng)計數(shù)后受精卵密度調(diào)節(jié)為30ind/10ml。約24h后, D形幼蟲孵出, 將各家系幼蟲轉(zhuǎn)移至另一300L圓柱形塑料缸中培育, 初始密度控制在20ind/10ml, 保證各個家系的密度基本一致。早期每天半量換水1次, 培育水溫27.0—29.6°C; 以湛江叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)、亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)和綠色巴夫藻(Pavlova viridis)為主要餌料, 連續(xù)充氣培養(yǎng)。附著后移苗至1000L的圓柱形塑料白缸中培育, 以自然海水為餌料來源, 適當(dāng)補充人工單胞藻, 每天換水1次, 每次2/3。每3—5d沖洗培育過程中塑料白缸1次。上述培育過程中, 所用器具用砂濾海水浸泡后沖洗干凈, 保持各家系間的隔離,避免幼蟲交叉污染。

1.4　生長數(shù)據(jù)測量及雜種優(yōu)勢計算

卵徑、幼蟲和殼長≤2000μm的稚貝均采用顯微鏡目微尺測量(目微尺精度±5μm), 殼長＞2000μm的稚貝采用電子游標(biāo)卡尺測量(精度±0.02mm), 每組均隨機取樣30個測量。日生長率的計算公式為:r(%)=[(Lt/L0)1/t?1]×100,Lt為結(jié)束時殼長(μm),L0為開始時殼長(μm),t為試驗天數(shù)(d)。

幼蟲存活率為單位體積幼蟲數(shù)與D形幼蟲數(shù)的百分比; 稚貝和幼貝階段的存活率為移池時收獲的數(shù)量與布入此池的數(shù)量的比值。

參照Zheng等(2011)使用的方法, 計算雜種優(yōu)勢潛力指數(shù)hp(heterosis potence index,hp)和雜種獲得hg(hybrid gain,hg):hp=Q/L, 其中Q=2F1?(P1+P2),L=P1–P2;hg=[(F1?MP)/MP]×100, 式中,F1是雜種子代的平均值, MP是中親值: MP=(P1+P2)/2。當(dāng)hp＞1.0時,雜交產(chǎn)生顯著的雜種優(yōu)勢; 當(dāng)hp＜–1.0時, 雜交產(chǎn)生雜交衰退; 當(dāng)–1.0＜hp＜1.0時, 雜交效果不明顯, 雜交沒有產(chǎn)生顯著的雜交效果, 也沒有產(chǎn)生雜交衰退。

參照Cruz等(1997)和Lamkey(1998)等的計算公式,計算中親雜種優(yōu)勢(mid-parent heterosis,HMP)和單親雜種優(yōu)勢(single-parent heterosis,Hx):HMP=[(FC?P)/P]×100,HX=[(FC?PX)/PX] ×100, 式中FC是雜交組合(正交或反交)平均殼長,P為雙親自繁組的平均殼長,PX是某一親本自繁組的平均殼長。

參照曹景林等(2000)公式計算超親優(yōu)勢Hph=[(F1?Pm)/Pm] ×100,F1為雜交子代某一性狀的平均值,Pm為雙親中某一性狀優(yōu)良的親本的平均值。

參照Zhang等(2007), 采用普通線性模型分析母本效應(yīng)(母本G和母本S)及交配方式(自繁、正交和反交)對殼長的影響: 模型如下:Yijk=μ+Pi+Mj+ (P×M)ij+eijk, 模型中,Yijk是來自第i個卵源j種交配方式下的第k個個體殼長, μ是常數(shù)項,Pi是卵源效應(yīng)(母本效應(yīng))(i=1, 2),Mj是交配方式影響(j=1, 2, 3), (P×M)ij是卵源與交配方式的交互影響,eijk是隨機誤差。

1.5　數(shù)據(jù)處理

生長數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件及EXCEL 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并作圖, 進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)并采用 LSD多重比較各家系間殼長的差異,差異顯著性設(shè)置為P＜0.05, 差異極顯著性設(shè)置為P＜0.01。

2　結(jié)果與分析

2.1　浮游期、稚貝和幼貝階段的生長比較

構(gòu)建成功的6個組合分別以江蘇文蛤、廣西文蛤為母本, 而兩者的卵徑存在顯著差異(P＜0.05), 前者為 90±3.62μm, 后者為 77.05±7.05μm。因此, 卵源的大小差異造成受精卵的大小差異。以廣西文蛤為母本的 Gg、Gs和 Gj在 1日齡時 D形幼蟲大小在123.00—124.25μm, 而以江蘇文蛤為母本的 Sg、Ss和Sj在1日齡時D形幼蟲大小在141.25—143.75μm。1—5日齡的浮游期內(nèi), 以江蘇文蛤為母本的3個組合的殼長均顯著大于以廣西文蛤為母本的 3個組合(P＜0.05)。表2反映了浮游期內(nèi)各組的生長差異, 說明浮游期存在母本效應(yīng)。從7月29日到8月2日的整個浮游期而言, 6個組合的日生長率存在大小差異,依次為 Gj＞Gs＞Sg＞Sj＞Gg＞Ss(見表3)。由此可見, 雜交組合的日生長率大于自繁組合。

表2　浮游期的殼長比較Tab.2　Comparison of shell length during the pelagic period

13—43日齡的稚貝隨著日齡的增加, 生長差異逐漸顯現(xiàn)(圖1)。13日齡時, 在前期日生長率的累積作用下, 各組合殼長大小依次為: Gj＞Sg＞Sj＞Gs＞Gg＞Ss, 雜交組合的殼長均大于自繁組合?？梢? 來自先天卵源間的差異逐漸被后天生長所打破。43日齡時,各組合殼長大小依次為: Gs＞Gj＞Sg＞Sj＞Gg＞Ss, Gg 和Ss差異不顯著(P＞0.05), 與 Gs、Gj、Sg和 Sj均顯著(P＜0.05)。從13—43日齡這一階段的日生長率來看(表3), Gs的日生長率最大, 其次分別為Sj、Gj和Sg, 最小分別為Ss和Gg。

圖1　稚貝的殼長比較Fig.1　Comparison in shell length during the early juvenile period

圖2　幼貝的殼長比較Fig.2　Comparison in shell length during the juvenile period

圖2為73—149日齡的幼貝殼長比較。73日齡、104日齡和 149日齡的殼長大小依次為 Gs＞Sj＞Gj＞Sg＞ Gg＞Ss, Gs＞Gj＞Sj＞Sg＞Gg＞Ss, Gs＞Gj＞Sj＞Sg＞Gg＞Ss,可見, 在這3個時期Gs的殼長均最大, Gg和Ss依然最小。由表3的73—149日齡日生長率可見, 6個組合日生長率的大小依次為: Gs＞ Gj＞ Sg ＞Sj＞ Ss＞ Gg。1—149 日齡的日生長率大小依次為: Gs＞Gj＞Sj＞Sg＞Gg＞Ss。因此, 雜交組合的生長快于自繁組。

表3　各階段的日生長率比較Tab.3　Comparison of daily growth rates in different stages

由此可見, 在浮游期、稚貝和幼貝階段, 雜交組合(Gj、Gs、Sg、Sj)在日生長率方面均表現(xiàn)出比自繁組(Gg、Ss)快的生長優(yōu)勢。浮游期受卵源因素的影響,尚未顯現(xiàn)出雜交組和自繁組殼長區(qū)別, 但在 13日齡以后的稚貝和幼貝階段, 雜交組比自繁組生長快的優(yōu)勢迅速顯現(xiàn), 并通過殼長明顯可以區(qū)別兩者的生長差異。由表4可見, 浮游期雜交組總體上未表現(xiàn)出生長優(yōu)勢, 因其大小主要受卵源與交配方式的影響,此時兩者的交互作用對殼長無顯著影響(P＞0.05); 其次是卵源的影響, 這時的大小差異主要來自卵源因素(P＜0.01), 而交配方式未起到影響作用(P＞0.05)。隨著日齡的增加, 交配方式對大小有顯著影響(P＜0.01),表現(xiàn)出雜交組比自繁的生長優(yōu)勢, 即雜種優(yōu)勢。在整個 1—149日齡階段, 未見有卵源與交配方式對殼長的交互作用, 除4日齡、104日齡和149日齡分別對殼長有顯著影響(P＜0.05)外, 均單獨對殼長有顯著影響(P＜0.05)。因此, 殼長早期主要受到卵源因素的影響, 之后主要受到交配方式影響。

表4　卵源與交配方式對生長的影響Tab.4　Impacts of egg origination and mating strategy on shell growth

2.2　各日齡存活率的比較

各交配組合各個培育日齡的成活率見表5。D形幼蟲首日存活率設(shè)定為100%, 1—5日齡內(nèi)幼蟲的存活率均在80%以上。5日齡時存活率大小順序為Gs＞Sg＞Gj＞Sj＞Gg＞Ss, 相互間差異不顯著(P＞0.05)。幼蟲變態(tài)附著后, 經(jīng)倒換池重新布苗, 并將此時的稚貝存活率定義為 100%; 13日齡時, 各交配組合均保持100%的存活率。43—73日齡期間, 除自繁組Ss的存活率最低為 79.83%外, 其余存活率均在 80%以上,表現(xiàn)出較高的存活率。104—149日齡期間, 各組幼貝的存活率大小依次為 Gs＞Sg＞Gj＞Sj＞Gg＞Ss。從 1—149日齡整個培育期間來看, 除 4日齡時 Gs的存活率低于其他交配組合, 但差異不顯著(P＞0.05), 其余日齡Gs的存活率均最高; 且43日齡后, 雜交組的存活優(yōu)勢更明顯。

表5　各階段成活率比較Tab.5　Comparison in survival rates in different stages

2.3　雜種優(yōu)勢比較分析

圖3中, 各雜交組殼長的雜種優(yōu)勢整體上隨日齡的增大而增大。除Sg、Sj和Gj分別在2日齡、1—2日齡和1日齡為負(fù)值, 其余日齡均為正值; Gs在1—149日齡均呈正值, 且雜種優(yōu)勢越來越明顯。由于只有Gs和Sg有雙親自繁組Gg和Ss, 因此只測算廣西群體G和江蘇群體S的中親雜交優(yōu)勢HMP, 其值一直大于 0, 且始終介于單親雜種優(yōu)勢HGs和HSg之間。如表6所示, 稚貝和幼貝階段, 中親雜種優(yōu)勢HMP和單親雜種優(yōu)勢HGs、HSj均顯著大于浮游期(P＜0.05);單親雜種優(yōu)勢HSg和HGj在浮游期、稚貝和幼貝這3個階段均有顯著差異(P＜0.05), 其中稚貝階段＞幼貝階段＞浮游期。就整個發(fā)育階段而言, 稚貝階段的雜種優(yōu)勢均大于幼貝階段, 浮游期最小。

圖3　在不同日齡時的雜種優(yōu)勢Fig.3　Heterosis shown on different days

表6　不同發(fā)育階段的雜種優(yōu)勢Tab.6　Heterosis shown in different stages

在1—149日齡, 只有早期1—5日齡的雜種優(yōu)勢潛力指數(shù)為負(fù)值, 為–0.80—-0.12, 介于–1和 1之間,說明沒有雜種優(yōu)勢產(chǎn)生, 且未出現(xiàn)負(fù)的雜種優(yōu)勢, 未產(chǎn)生雜種衰退; 其余均為正值, 且均大于1, 說明有正的雜種優(yōu)勢產(chǎn)生, 獲得了雜種優(yōu)勢。圖4還可見, 殼長性狀的雜種獲得均為正值, 特別是稚貝以后殼長的雜種獲得都大于 22.80%, 說明殼長性狀得到了顯著改良。表7統(tǒng)計了Gs和Sg的超親優(yōu)勢率, 13日齡之后Gs和Sg均有超親優(yōu)勢率。

圖4　在不同日齡時的雜種優(yōu)勢潛力指數(shù)及雜種獲得Fig.4　Potence index and hybrid gain on different days

2.4　子代的殼色表現(xiàn)

在自然界中, 廣西、江蘇和日本這3個群體中紅殼個體均只有1%—3%。3個群體的紅殼個體經(jīng)雜交和自繁, 子代中紅殼個體的比例均有顯著提高, 數(shù)值介于72.80%—76.49%(表8)。說明紅殼可以得到一進(jìn)步純化。

表7　不同發(fā)育階段的超親優(yōu)勢率Tab.7　Super-parent heterosis shown in different stages

表8　雜交、自繁子代的殼色表現(xiàn)Tab.8　Shell color between hybrid and self-fertilized generations

3　討論

3.1　母本效應(yīng)

母本效應(yīng)對動物早期發(fā)育階段的生長是一個非常重要的影響因素。個體在其生長發(fā)育的早期階段,比較容易受到母本效應(yīng)的影響, 而后母本效應(yīng)減弱或消失, 雜種優(yōu)勢得以充分表達(dá)。牡蠣的種間雜交、海灣扇貝(Argopecten irradians)的群體雜交、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的雜交等研究中均有類似發(fā)現(xiàn)(Newkirket al, 1977; 閆喜武等, 2008; 張國范等, 2009)。大量研究認(rèn)為, 在種間或同種的不同群體間雜交時, 雜交個體在不同環(huán)境下的遺傳變異程度很難確定, 由于不同種間、群體間個體的營養(yǎng)積累程度、卵徑大小、攜帶的卵內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)多少均不同,故在胚胎發(fā)育早期表現(xiàn)顯著的母本效應(yīng)。本試驗中,1—5日齡浮游期內(nèi)各組合的生長主要受到母本效應(yīng)影響。造成這種情況的原因在于母本來自不同群體,且母本間存在著顯著的卵徑大小差異。卵徑大小的差異反映出卵所儲存的能量存在差異, 而這些能量恰恰是幼蟲早期發(fā)育階段的主要營養(yǎng)來源(Cruzet al,1997), 這可能是本試驗中產(chǎn)生母本效應(yīng)的原因。

3.2　雜種優(yōu)勢

本研究表明, 文蛤各雜交組的雜種優(yōu)勢在各個生長階段所有差異。其他研究也表明不同生長階段雜種優(yōu)勢存在差異, 如閆喜武等(2008)在菲律賓蛤仔不同殼色品系間雜交中發(fā)現(xiàn), 在不同階段雜種優(yōu)勢的平均水平有所不同; Cruz等(1997)發(fā)現(xiàn)兩個扇貝群體雜交幼蟲在0—11日齡生長的雜種優(yōu)勢為0, 17日齡時卻能達(dá)到6.8%。此外, 本研究表明正交組Gs雜種優(yōu)勢與反交組Sg存在著明顯差異。在不同貝類群體、品系間進(jìn)行雜交研究普遍都認(rèn)識到正反交組合的雜種優(yōu)勢有差異, 如海灣扇貝、長牡蠣(Crassostreagigas)、美洲牡蠣(Crassostrea virginica)等中這種差異是一種比較常見的現(xiàn)象(Malletet al, 1984; Hedgcocket al, 1995; Cruzet al, 1997)。

為了有效評估雜種優(yōu)勢, 在本研究的完全2×2雙列雜交中引入了雜種潛力指數(shù)這一概念(Zhenget al,2010)。這種判斷方法先后在評定亞種間、種間雜交時具有高度適用性, 取得了較為理想的評估效果(張國范等, 2009)。雜種潛力指數(shù)可作為判斷雜交是否真正產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的依據(jù), 因為只有當(dāng)雜種子代均值超過最大親本值時, 雜種潛力指數(shù)才大于1.0(張國范等, 2009)。紅殼文蛤不同地理群體間的雜交, 雜種獲得均為正值, 特別是稚貝以后, 殼長的雜種獲得顯著高于22.80%。73日齡時, 雜交優(yōu)勢率較低, 造成此結(jié)果的原因在于自繁組的生長增加較快, 大于同期雜交組的生長增幅; 但 73日齡之后的各日齡, 雜交組的生長快于自繁組, 雜種優(yōu)勢明顯。73日齡時的雜交優(yōu)勢率波動的具體原因還有待進(jìn)一步研究分析, 但雜交組的雜種優(yōu)勢確實存在, 這種正的雜種優(yōu)勢潛力指數(shù)及雜種獲得應(yīng)歸因于這兩個不同地理群體間存在著一定的遺傳差異, 林志華等(2008)利用 AFLP等分析結(jié)果表明廣西文蛤和江蘇文蛤確實存在較大的遺傳差異。總之, 本研究的結(jié)果充分表明紅殼文蛤不同地理群體雜交能獲得正的雜種優(yōu)勢, 雜交組在生長速度方面優(yōu)于對照組, 說明不同地理群體間的雜交可能是文蛤遺傳改良的一條有效途徑。

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