鄒李昶　任夙藝　王志錚①　朱衛(wèi)東　吳一挺

(1. 浙江海洋學(xué)院　舟山　316022; 2. 余姚市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心　余姚　315400; 3. 舟山市海洋與漁業(yè)局　舟山　316000)

氨氮作為含氮化合物的主要最終產(chǎn)物和積聚于水體中的重要無(wú)機(jī)污染物(Coltet al, 1981; Alonsoet al, 2004; Prenteret al, 2004), 既是評(píng)價(jià)水域環(huán)境質(zhì)量的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo), 也是反映水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物存活狀況的重要環(huán)境因子。已有研究表明, 氨氮既能直接損害甲殼動(dòng)物的鰓組織, 也可通過(guò)滲入血淋巴引起甲殼動(dòng)物免疫力下降, 代謝機(jī)能紊亂和病原致敏性提高(Chenet al, 1992b; Ackermanet al, 2006; Spenceret al,2008; Sunget al, 2011; 蔣琦辰等, 2013), 故極易引發(fā)甲殼動(dòng)物爆發(fā)性疾病的發(fā)生。日本沼蝦Macrobrachium nipponensis(De Haan, 1849)系我國(guó)重要的淡水蝦類養(yǎng)殖對(duì)象之一, 池塘高密度養(yǎng)殖往往會(huì)導(dǎo)致堆積于池底的大量殘餌經(jīng)氨化作用使水體中氨氮濃度急劇升高, 因而系統(tǒng)地開展氨氮對(duì)日本沼蝦的毒害作用與機(jī)制研究, 并據(jù)此探析進(jìn)而確定其氨氮安全耐受限量, 無(wú)疑對(duì)指導(dǎo)該蝦的安全養(yǎng)殖生產(chǎn)具重要現(xiàn)實(shí)意義。

研究表明, NH3對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具強(qiáng)毒性(Alonsoet al, 2004), 雖然其在氨氮中的存在比例主要受制于水體中的溫度、pH和鹽度(Chenet al, 1992a, 1993),但溶解氧也將直接影響其毒性作用的發(fā)揮。據(jù)報(bào)道, 非離子氨的毒性與水中溶解氧含量呈負(fù)相關(guān)(Thurstonet al, 1981), 高溶解氧可顯著提高羅氏沼蝦(王龍等,2011)和中國(guó)對(duì)蝦(王娟等, 2007)等甲殼動(dòng)物對(duì)非離子氨的耐受能力。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于氨氮對(duì)日本沼蝦生態(tài)毒理方面的研究, 僅涉及受氨氮脅迫下飼料中添加維生素 C對(duì)日本沼蝦耗氧率、排氨率及 Na+/K+ATPase的影響(Wanget al, 2003), 以及持續(xù)充氧條件下氨氮急性脅迫對(duì)日本沼蝦酚氧化酶活力、血細(xì)胞數(shù)量及血藍(lán)蛋白含量的影響(張亞娟等, 2008, 2010), 而有關(guān)靜水實(shí)驗(yàn)條件下氨氮對(duì)該蝦的急性毒害作用及其安全耐受限量的定量研究則迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此, 本文作者于2010年8—9月采用靜水停食法在余姚市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)就氨氮對(duì)日本沼蝦死亡率、耗氧率及窒息點(diǎn)的影響開展了較為系統(tǒng)的研究, 在獲悉氨氮對(duì)該蝦的急性致死作用并求得 96h LC50值后, 采用SC = 0.1×96h LC50(Sprague, 1971)估算氨氮安全質(zhì)量濃度, 并以此為終點(diǎn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度梯度, 通過(guò)測(cè)定耗氧率和窒息點(diǎn), 在核驗(yàn)該估算值可靠性的同時(shí), 確定該蝦的安全耐受限量。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1日本沼蝦購(gòu)自余姚市馬渚鎮(zhèn)青豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng), 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)基地馴養(yǎng)4—5d(馴養(yǎng)期間不投喂飼料)后, 選取其中肢體完好、規(guī)格相近、反應(yīng)敏捷的健壯個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 具體規(guī)格為體長(zhǎng)(4.29±0.32)cm、體質(zhì)量(1.80±0.12)g。

1.1.2試劑NH4Cl和液體石蠟均為AR級(jí), 分別購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和無(wú)錫市晶科化工有限公司。按需用雙蒸水將 NH4Cl制成一定質(zhì)量濃度的母液, 現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3理化條件以自然曝氣 48h的自來(lái)水為實(shí)驗(yàn)用水, 水溫(24±0.2)°C, pH 7.61±0.04, DO (7.24±0.14)mg/L, 水質(zhì)符合《NY 5051-2001無(wú)公害食品 淡水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部, 2001)要求。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1氨氮對(duì)日本沼蝦的急性毒性實(shí)驗(yàn)在室溫條件下, 以規(guī)格60cm×35cm×30cm的白色塑料箱為實(shí)驗(yàn)容器(實(shí)驗(yàn)實(shí)際容積為20L), 依次設(shè)0(對(duì)照組)、1.346、2.355、3.701、5.720、9.421mg/L等6個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度(每一梯度設(shè)3個(gè)平行, 每個(gè)平行放實(shí)驗(yàn)蝦10尾),采用靜水停食實(shí)驗(yàn)法開展氨氮對(duì)日本沼蝦的急性毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間, 連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)蝦的活動(dòng)狀況, 并按王志錚等(2013)確定的死亡個(gè)體判定標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)取出死亡個(gè)體, 每24h換液并統(tǒng)計(jì)1次總體死亡率。

1.2.2氨氮對(duì)日本沼蝦耗氧率和窒息點(diǎn)的影響實(shí)驗(yàn)依次設(shè) 0(對(duì)照組)、0.056、0.112、0.169、0.225、0.281和0.337mg/L等 6個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度, 并按王志錚等(2013)的實(shí)驗(yàn)方法開展氨氮對(duì)日本沼蝦耗氧率和窒息點(diǎn)的影響實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)時(shí)間均始于22:00。

1.3　數(shù)據(jù)處理

根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 建立 24h、48h、72h、96h等不同觀察時(shí)段氨氮質(zhì)量濃度(x)與日本沼蝦死亡概率單位(y)間的直線回歸方程; 應(yīng)用 SC = 0.1×96h LC50求得氨氮安全質(zhì)量濃度估算值, 并借助各實(shí)驗(yàn)時(shí)段MAC值(王志錚等, 2007)的變化特征分析實(shí)驗(yàn)蝦對(duì)氨氮的蓄積與降減動(dòng)態(tài); 晝、夜區(qū)間耗氧率的統(tǒng)計(jì)時(shí)段分別按6:00至18:00和18:00至翌日6:00, 并采用 LSD多重比較法分別檢驗(yàn)耗氧率、窒息點(diǎn)的組間差異顯著性(a=0.05)。上述統(tǒng)計(jì)分析均借助 SPSS 17.0軟件來(lái)完成。

2　結(jié)果

2.1　急性毒性死亡率與死亡癥狀

除對(duì)照組外, 相同氨氮質(zhì)量濃度組日本沼蝦的死亡率均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加, 相同實(shí)驗(yàn)時(shí)段內(nèi)日本沼蝦的死亡率均隨氨氮質(zhì)量濃度的提高而增加(圖1)。觀察發(fā)現(xiàn), 瀕死實(shí)驗(yàn)蝦鰓組織均出現(xiàn)不同程度的受損變白癥狀, 且該癥狀隨氨氮質(zhì)量濃度增大和攻毒時(shí)間延長(zhǎng)而變得愈加明顯, 表明鰓是氨氮攻毒日本沼蝦的重要靶器官, 氨氮攻毒該蝦的時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)與其鰓組織受損情形關(guān)聯(lián)密切。

圖1　氨氮對(duì)日本沼蝦的急性毒性Fig.1　Acute toxicity of ammonia-N on M. nipponensis

2.2　急性致毒特征

日本沼蝦24h、48h、72h、96h的LC50值分別為7.922、6.034、4.237 和 3.371mg/L(表1); 經(jīng)計(jì)算, 實(shí)驗(yàn)24—48h、48—72h、72—96h時(shí)段的MAC值依次為41.5%、39.5%和19.0%, 表明氨氮對(duì)日本沼蝦的致死作用強(qiáng)度與實(shí)驗(yàn)時(shí)間呈正相關(guān), 而在其體內(nèi)的蓄積作用強(qiáng)度卻與實(shí)驗(yàn)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)估算, 日本沼蝦對(duì)氨氮的安全質(zhì)量濃度為0.337mg/L。

2.3　耗氧率

由圖2可見(jiàn), 各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在時(shí)段耗氧率間的變化上均趨于一致, 且耗氧率均呈夜均＞日均＞晝均, 表明各實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦的呼吸生理節(jié)律均未發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變; 與此同時(shí), 各時(shí)段及夜均、日均、晝均耗氧率隨氨氮質(zhì)量濃度的梯次增加均呈“∩”型走勢(shì)的結(jié)果, 進(jìn)一步表明本研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的氨氮可致日本沼蝦耗氧率表露毒物興奮效應(yīng)(hormesis)。

表1　氨氮對(duì)日本沼蝦的急性致毒特征Tab.1　The acute toxic characteristic of ammonia-N to M. nipponensis

圖2　氨氮對(duì)日本沼蝦耗氧率晝夜節(jié)律的影響Fig.2　The effect of ammonia-N on oxygen consumption rate of circadian rhythm in M. nipponensis

由圖2可知, 在本研究所設(shè)各實(shí)驗(yàn)組中, 各時(shí)段耗氧率以及晝均、夜均和日均耗氧率均以氨氮質(zhì)量濃度 0.225mg/L實(shí)驗(yàn)組為最高(P＜0.05), 而 0.337mg/L實(shí)驗(yàn)組不僅晝均、夜均耗氧率與對(duì)照組均無(wú)差異(P＞0.05), 且在所觀測(cè)的12個(gè)時(shí)段中耗氧率與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)的時(shí)段也多達(dá) 9個(gè), 為本研究諸實(shí)驗(yàn)組中與對(duì)照組耗氧率相似性最高的實(shí)驗(yàn)組別, 故致日本沼蝦耗氧率表露毒物興奮效應(yīng)峰值的氨氮質(zhì)量濃度為 0.225mg/L, 而致日本沼蝦毒物興奮效應(yīng)被終止的氨氮質(zhì)量濃度則為0.337mg/L。

2.4　窒息點(diǎn)

由圖3可見(jiàn), 實(shí)驗(yàn)組窒息點(diǎn)氧含量隨氨氮質(zhì)量濃度的增加依次呈穩(wěn)定、略增、再穩(wěn)定之態(tài)勢(shì)。其中, 對(duì)照組窒息點(diǎn)氧含量?jī)H與0.056mg/L、0.112mg/L氨氮質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著差異(P＞0.05), 氨氮質(zhì)量濃度0.169、0.225、0.281和0.337mg/L實(shí)驗(yàn)組窒息點(diǎn)氧含量間均無(wú)顯著差異(P＞0.05), 與對(duì)照組和氨氮質(zhì)量濃度 0.169mg/L實(shí)驗(yàn)組窒息點(diǎn)氧含量均無(wú)顯著差異(P＞0.05)的組別僅為0.112mg/L實(shí)驗(yàn)組, 表明致該蝦窒息點(diǎn)發(fā)生顯著改變的氨氮臨界閾質(zhì)量濃度為0.112mg/L。

圖3　氨氮對(duì)日本沼蝦窒息點(diǎn)的影響Fig.3　Effects of ammonia-N on the suffocation point of M. nipponensis

3　討論

Thurston等(1981)指出, 非離子氨對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的毒害作用強(qiáng)度與水中溶解氧含量呈負(fù)相關(guān)。據(jù)報(bào)道, 水溫(23±1)°C、pH 7.11±0.07 條件下, 非離子氨對(duì)全長(zhǎng)3cm左右羅氏沼蝦溶解氧7mg/L、11mg/L實(shí)驗(yàn)組的96h LC50值分別為0.83 mg/L和1.425 mg/L (王龍等, 2011); 水溫21°C、鹽度30—31、pH 7.99條件下, 非離子氨對(duì)體長(zhǎng)1.9—2.1cm中國(guó)對(duì)蝦溶解氧5.5—6.0mg/L、10—12mg/L實(shí)驗(yàn)組的96h LC50值分別為0.98mg/L和1.52mg/L (王娟等, 2007)。研究發(fā)現(xiàn), 體長(zhǎng)3.5—4.1cm的日本沼蝦在水溫(25.0±1)°C條件下,饑餓2d內(nèi)的超氧陰離子OD值與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05), 且其 SOD、CAT活力均顯著大于對(duì)照組(P＜0.05), 饑餓4d時(shí)不僅其超氧陰離子OD值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 而且SOD、CAT活力也均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05), 饑餓6d后其超氧陰離子OD值極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01), 且SOD、CAT活力均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)(李志華等, 2007), 體長(zhǎng) 4.2—5.2cm的日本沼蝦在水溫20°C條件下, 其饑餓代謝適應(yīng)區(qū)和饑餓存活適應(yīng)區(qū)分別為饑餓處理 2—4d和饑餓處理8—10d , 且SOD活力隨饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降(張靜等, 2007), 表明饑餓4d為日本沼蝦的免疫抗逆能力和代謝水平出現(xiàn)顯著下滑的臨界點(diǎn)。故在水溫、pH及實(shí)驗(yàn)蝦體長(zhǎng)和體質(zhì)量規(guī)格均相近條件下,停食1d后連續(xù)充氣培養(yǎng)的日本沼蝦受氨氮質(zhì)量濃度36.6mg/L攻毒24h后的成活率仍為100% (張亞娟等,2008, 2010), 而本研究所獲氨氮對(duì)日本沼蝦的 24h LC50值則僅為 7.922mg/L (停食馴養(yǎng) 4—5d后開始實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)期間不充氣)的根本原因, 無(wú)疑為兩者間在實(shí)驗(yàn)供氧方式和實(shí)驗(yàn)用蝦馴養(yǎng)方法選擇上的差異共同所致。據(jù)報(bào)道, 在與本研究相同水溫及相近 pH條件下, 體質(zhì)量(0.942±0.187)g的日本沼蝦受氨氮攻毒的96h LC50值為36.6mg/L (Wanget al, 2003), 遠(yuǎn)高于本研究所獲的 3.371mg/L [實(shí)驗(yàn)蝦體質(zhì)量為(1.80±0.12)g], 表明日本沼蝦養(yǎng)成后期對(duì)氨氮攻毒更具敏感性。綜上, 為進(jìn)一步規(guī)避養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn), 應(yīng)在該蝦養(yǎng)殖后期切實(shí)提高其生長(zhǎng)所需的食物和溶氧保障水平。

毒物興奮效應(yīng)是生物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為提高在各種低水平脅迫下的成活率而形成的一種順應(yīng)自然選擇的生理機(jī)制, 意在當(dāng)生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)(homostatic)受損后能迅速獲得恢復(fù)(Calabreseet al, 2001)。據(jù)報(bào)道, 非離子氨對(duì)甲殼動(dòng)物的毒害作用往往表露為鰓組織受損及血淋巴 pH的改變(Coltet al, 1981;Romanoet al, 2007), 水環(huán)境中過(guò)高質(zhì)量濃度的非離子氨不僅會(huì)導(dǎo)致甲殼動(dòng)物耗氧量的增加和血藍(lán)蛋白濃度的下降(Chenet al, 1994; Racpttaet al, 2000), 而且也將直接妨礙鰓的排氨作用(Spiceret al, 1994;Maltby, 1995)。因此, 張亞娟等(2008, 2010)所報(bào)道的日本沼蝦酚氧化酶活力、血細(xì)胞數(shù)量和血藍(lán)蛋白含量均隨水環(huán)境中氨氮質(zhì)量濃度的增加而呈先升后降趨勢(shì), 在連續(xù)充氣狀態(tài)下血藍(lán)蛋白含量達(dá)到峰值的氨氮質(zhì)量濃度為 2.2mg/L (P＜0.05), 遠(yuǎn)低于酚氧化酶活力和血細(xì)胞數(shù)量均達(dá)到峰值的氨氮質(zhì)量濃度8.7mg/L(P＜0.05)的情形, 與本研究中瀕死日本沼蝦鰓組織受損變白癥狀隨氨氮質(zhì)量濃度增大和攻毒時(shí)間延長(zhǎng)而變得愈加明顯的現(xiàn)象, 以及隨氨氮質(zhì)量濃度的梯次增加, 日本沼蝦各時(shí)段耗氧率及夜均、日均、晝均耗氧率均呈“∩”型走勢(shì)(圖2)和窒息點(diǎn)呈穩(wěn)定、略增和再穩(wěn)定之態(tài)勢(shì)(圖3)的結(jié)果, 均表明以呼吸生理補(bǔ)償為代價(jià)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)保持機(jī)制是引發(fā)日本沼蝦受氨氮急性脅迫下其耗氧率表露毒物興奮效應(yīng)的主因, 這就為人們從呼吸生理變化特征的角度來(lái)進(jìn)一步表征氨氮對(duì)日本沼蝦的安全質(zhì)量濃度提供了重要的證據(jù)支持。目前, 國(guó)內(nèi)外有關(guān)毒物對(duì)目標(biāo)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物安全質(zhì)量濃度值的估算多采用SC = 0.1×96h LC50, 因96h LC50值具相應(yīng)的置信區(qū)間, 故實(shí)際上SC值的設(shè)定也應(yīng)具上、下限。由此, 在致日本沼蝦耗氧率表露毒物興奮效應(yīng)的氨氮質(zhì)量濃度范圍內(nèi), 可將0.112mg/L這一致日本沼蝦尚未越過(guò)該效應(yīng)耗氧率峰值且窒息點(diǎn)氧含量處于臨界閾水平的氨氮質(zhì)量濃度, 定義為日本沼蝦安全質(zhì)量濃度取值范圍的下限; 將 0.337mg/L這一致日本沼蝦耗氧率終止毒物興奮效應(yīng)且窒息點(diǎn)含氧量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)的氨氮質(zhì)量濃度(圖2, 圖3), 定義為日本沼蝦安全質(zhì)量濃度取值范圍的上限, 其與急性毒性實(shí)驗(yàn)所獲的估算值(SC = 0.1×96h LC50)完全一致(表1)。

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