任利華　李　斌　孫國華　張秀珍①　楊建敏　姜　芳　劉麗娟　劉兆存

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院　山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)　煙臺　264006; 2. 山東華春漁業(yè)有限公司　東營　257236)

生物絮團(tuán)(biofloc)是異養(yǎng)微生物、藻類、原生動物及其胞外物等在水體中形成的絮狀懸浮物, 作為海洋微生物的集合體, 在海水生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的地位(Simonet al, 2002; 包衛(wèi)洋等, 2010)。生物絮團(tuán)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有凈化水質(zhì)和為養(yǎng)殖動物提供餌料等作用, 能夠明顯降低養(yǎng)殖成本, 提高成活率和生長率(Burfordet al, 2004; Hariet al, 2004; Kuhnet al,2010)。仿刺參(Apostichopus japonicus)又稱刺參, 是我國北方重要的養(yǎng)殖種類, 但隨集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展, 養(yǎng)殖水體中無機(jī)氮、有機(jī)物積累, 造成養(yǎng)殖環(huán)境污染病害流行, 制約了刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展(喬聚海等, 2009)。將生物絮團(tuán)技術(shù)應(yīng)用于刺參苗種培育, 可以有效提高其生長率、成活率及免疫酶活性(張秀珍等, 2014), 利用生物絮團(tuán)技術(shù)解決當(dāng)前刺參養(yǎng)殖過程中潛在的環(huán)境問題, 保持刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。生物絮團(tuán)中主要活性功能成分——微生物群落結(jié)構(gòu)組成對生物絮團(tuán)特定功能的行使起著重要作用, 進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征和多樣性研究是解析生物絮團(tuán)功能作用并有效利用的基礎(chǔ)。

評價環(huán)境樣本中的微生物多樣性最精確的方法就是獲得其克隆的序列信息, 克隆文庫的構(gòu)建是環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)中用來研究微生物組成的常用方法之一(Pace, 1997), 目前細(xì)菌菌群分析中應(yīng)用最多的是16S rDNA克隆文庫方法。它通過對16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、分析和鑒定, 達(dá)到研究和監(jiān)測樣品與環(huán)境中細(xì)菌多樣性、種群結(jié)構(gòu)和區(qū)系變化的目的(Bakeret al, 2001; Brambillaet al, 2001)。由于這一方法不需要得到環(huán)境中微生物的純培養(yǎng), 突破了用傳統(tǒng)的微生物分離純化的方法調(diào)查環(huán)境中微生物多樣性時很多微生物無法得到純培養(yǎng)的限制, 因此這一方法目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于土壤、水體、沉積物、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查(Giovalmonietalet al, 1990; Saleenaet al, 2002; Zhanget al,2007), 并且揭示了環(huán)境中前所未知的微生物多樣性。本研究利用16S rDNA基因建庫法對刺參苗種培育池中生物絮團(tuán)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定, 旨在為評價生物絮團(tuán)中功能微生物的組成提供依據(jù), 并能進(jìn)一步揭示生物絮團(tuán)的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)設(shè)計與樣品采集

以采用生物絮團(tuán)技術(shù)的刺參養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)分別在東營和蓬萊刺參育苗池進(jìn)行調(diào)控。利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)與蔗糖一同加入聚乙烯水槽中, 自然海水中連續(xù)發(fā)酵4d制備生物絮團(tuán), 過濾濃縮后備用。蔗糖與芽孢桿菌添加量分別為0.1 g/L和1.5×105cell/mL, 水溫為22—25°C。持續(xù)充氧, 每天充分?jǐn)嚢?次。

幼參苗種培育池為水泥池, 池中水體體積為10 m3,每池幼參苗種密度為1.0 kg/m3水體; 刺參平均體重(1.6±0.8) g/頭。處理組每4天倒池、換水1次, 每次換水量為1/2—2/3; 處理組倒池后補(bǔ)充 100×10–6的生物絮團(tuán)濃縮液, 每 2天向池中加入蔗糖 1次, 蔗糖添加量按C/N20計; 對照組每2天倒池并全量換水1次, 不添加蔗糖和生物絮團(tuán)濃縮液。在第 30天時取 500 mL海水抽濾收集微生物樣, 進(jìn)行DNA的提取。

1.2　宏基因組DNA的提取

本研究中宏基因組 DNA的提取參照 Zhou等(1996)的SDS-based DNA方法, 并對其進(jìn)行了適當(dāng)修改。稱取 0.1g樣品, 加入 0.6mL清洗液, 振蕩混勻,55°C 水浴 5min后, 離心去上清, 重復(fù) 2次; 加入0.4mL DNA 抽提緩沖液, 震蕩混合后 37°C 水浴30min, 然后加入 80μL 10% SDS, 4μL蛋白酶 K, 55°C水浴2h; 加入1/2體積4.5mol/L的NaCl, 混合均勻后,再加入等體積的氯仿-異戊醇(24︰1), 輕微震蕩15min后, 12000r/min離心5min, 取上清; 加入0.6倍體積的異丙醇, 混勻, 室溫靜置15min后, 12000r/min離心15min, 超純水溶解沉淀。溶解的DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測。

1.3　PCR擴(kuò)增16S rDNA片段

細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增采用通用引物341F: 5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’, 907R: 5’-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3’。PCR 反應(yīng)體系(50μL): 10×PCR Buffer (Mg2+Plus) 5μL, dNTP (10mmol/L) 4μL,341F (10nmol/L) 1μL, 907R (10nmol/L) 1μL, DNATaq(5U/μL) 0.5μL, DNA 模板(100 ng/μL) 2μL, 超純水補(bǔ)至 50μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 94°C5min; 94°C45s,55°C45s, 72°C45s, 30cycles; 72°C10min, 4°C 保溫。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4　16S rDNA文庫構(gòu)建

產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TaKaRa)純化,連接至pMD18-T載體(TaKaRa), 連接體系: PCR產(chǎn)物4.5μL, pMD18-T simple vector 0.5μL, SolutionΙ5μL,總體積20μL。將連接混合液輕輕混勻, 于16°C連接5h。連接產(chǎn)物與100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 42°C熱激轉(zhuǎn)化,涂布于含有氨芐青霉素平板, 置 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。挑取陽性克隆, 以pMD18-T載體引物RV- M和M13-47作為菌落PCR的引物, 用于檢測挑取的克隆是否為陽性克隆以及插入片段大小, 插入片段大小合適的克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用DNAMAN、Gene Tool等軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯、分析; 利用RDP在線程序Classifier及NCBI數(shù)據(jù)庫的Blastn程序?qū)λ玫降?6S rDNA序列進(jìn)行分析; 利用Mothur軟件進(jìn)行OTU分類, 估算每個克隆文庫文庫覆蓋百分率(Coverage)、文庫豐富度指數(shù)(Chao), 基因多樣性指數(shù)Shannon (H)、Pielou均勻度指數(shù)J(Schlosset al, 2009)。下載RDP數(shù)據(jù)庫相關(guān)門屬代表序列作為參考序列, 使用Mega5.0軟件包, 以鄰接法(Neighbor Joining Analysis)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果

2.1　基因組提取與16S rDNA目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

東營和蓬萊刺參育苗池的四個樣品宏基因組提取電泳結(jié)果顯示: 基因組條帶清晰無明顯降解, OD260/OD280的比值范圍為 1.6—1.9, 基本上沒有蛋白質(zhì)和RNA污染, 提取的基因組質(zhì)量較好, 適于PCR反應(yīng)。細(xì)菌16S rDNA通用擴(kuò)增引物341F和907R擴(kuò)增得到550bp左右長度序列, PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示, 四個絮團(tuán)樣品基因組均擴(kuò)增出清晰明亮條帶, 產(chǎn)物長度符合預(yù)期。

圖1　樣品宏基因組16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1　Electrophoretogram of 16S rDNA PCR products of metagenomes

2.2　16S rDNA文庫構(gòu)建結(jié)果

對東營和蓬萊處理池的生物絮團(tuán)及其對照分別構(gòu)建16S rDNA克隆文庫, 分別記作DYt、DYc、PLt、PLc。每個文庫隨機(jī)挑取陽性克隆 120個左右, 測序除去空載及不正確插入, 共獲得16S rDNA序列420條, 文庫 DYt、DYc、PLc、PLt分別為 93、91、115、121條。測序結(jié)果去除載體序列, 通過Mothur軟件分析, 把相似性≥97%的序列定義為同一個可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU), 文庫 DYt、DYc、PLt、PLc分別含有42、55、62 和79 個OTU(表1)。下載RDP數(shù)據(jù)庫放線菌綱(Actinobacteria) S000000827、擬桿菌綱(Bacteroidetes) S000001704、黃桿菌綱(Flavobacteria) S000115513、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)S000008354、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria) S000001467、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria) S000001126、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria) S000004853、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria) S000021184、螺旋體綱(Spirochaetes) S000001187、芽孢桿菌綱(Bacilli)S0000 00169、梭菌綱(Clostridia) S000000413和uncultured bacterium S000016962代表序列12條, 與各樣品OTU代表序列構(gòu)建聚類樹如圖2。四個文庫樣品 OTU序列形成明顯聚群, 其中與擬桿菌門(Bacteroidetes)中三個菌綱序列所形成聚群為主要優(yōu)勢聚群, 變形細(xì)菌門(Proteobacteria)次之; 蓬萊地區(qū)兩樣品文庫中擬桿菌門 OTU數(shù)量明顯多于東營地區(qū)樣品。四個文庫Coverage在34.7%—54.8%之間, 文庫豐富度指數(shù)(Chao)66.2—314.1, Shannon多樣性指數(shù)從3.01—4.07變動,Pielou均勻度指數(shù)0.68—0.85 (表1)。

表1　16S rDNA文庫序列數(shù)量及多樣性參數(shù)Tab.1　Number of 16S rDNA library sequence and diversity parameters

2.3　生物絮團(tuán)樣品細(xì)菌種類分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫和RDP數(shù)據(jù)庫比對, 對所有有效序列進(jìn)行分類, 獲得的420個序列可以劃分為擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形細(xì)菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)。此外, 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在一些無法確定其分類位置的序列, 這些序列多與來自環(huán)境樣品的未培養(yǎng)細(xì)菌具有更高相似性, 可見刺參育苗池的生物絮團(tuán)中存在大量未被認(rèn)知的微生物類群。各樣品文庫細(xì)菌種類分類及所占數(shù)量百分比見表2, 不同類型菌群在DYc、DYt、PLc、PLt四個樣品文庫中的數(shù)量有所不同, 擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形細(xì)菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)為三大主要細(xì)菌門, 其中擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌數(shù)量最多, 其數(shù)量百分比在每個文庫中均超過40%; 變形菌門數(shù)量百分比其次。疣微菌門(Verrucomicrobia)和螺旋體門(Spirochaetes)存在于蓬萊生物絮團(tuán)樣品文庫, 而藍(lán)細(xì)菌門和酸桿菌門則少量存在于東營地區(qū)。

統(tǒng)計三大主要細(xì)菌門中主要菌綱序列數(shù)量占總文庫數(shù)量及其本門的百分比(圖3, 表3)。黃桿菌群(Flavobacteria)為擬桿菌門(Bacteroidetes)中的優(yōu)勢菌群, 占文庫總數(shù)量的30%以上, 經(jīng)過生物絮團(tuán)技術(shù)處理后 DYt(47.13%)和 PLt(35.07%)均高于對照組文庫DYc(36.68%)和 PLc(31.30%), 且其門內(nèi)百分比也有所增加; 在東營地區(qū)樣品文庫DYc和DYt中, 黃桿菌群(Flavobacteria)占總文庫數(shù)量及其本門百分比均高于蓬萊地區(qū)樣品文庫 PLc和 PLt。α-變形菌群(Alphaproteobacteria)為變形菌門的優(yōu)勢菌群, 經(jīng)過生物絮團(tuán)處理后 DYt(23.45%)和 PLt(20.42%)均低于對照組文庫 DYc(34.50%)和 PLc(26.75%), 其數(shù)量占本門百分比亦有所減少; 東營地區(qū)樣品文庫均高于蓬萊地區(qū), 其中東營對照樣品DYc文庫中α-變形菌群占本門百分比高達(dá)93.5%。ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)僅出現(xiàn)在經(jīng)過生物絮團(tuán)技術(shù)調(diào)控處理后文庫, 在DYt和PLt文庫中門內(nèi)百分比分別為12.5%和4.5%。厚壁菌門中主要為芽孢桿菌綱(Bacilli)和梭菌綱(Clostridia)菌群, 作為添加有益菌, 優(yōu)勢菌綱芽孢桿菌(Bacilli)數(shù)量比例在生物絮團(tuán)培養(yǎng)后進(jìn)一步加大,在蓬萊地區(qū)樣品中調(diào)控效果明顯, 總文庫數(shù)量比由2.94%升至11.21%, 門內(nèi)數(shù)量比相應(yīng)增加。

圖2　四個樣品文庫OTU代表序列聚類系統(tǒng)樹Fig.2　Dendrograms of OTU sequences in four libraries

表2　16S rDNA文庫中主要細(xì)菌門及數(shù)量百分比Tab.2　Main bacterial phyla and percentages in 16S rDNA libraries

圖3　主要細(xì)菌綱占總文庫數(shù)量百分比Fig.3　Percentage of main bacterial classes in the libraries

表3　三大主要細(xì)菌門內(nèi)各菌綱百分比Tab.3　Percentage of main bacterial classes within three major phyla

3　討論

3.1　生物絮團(tuán)細(xì)菌多樣性

本研究東營和蓬萊地區(qū)四個樣品16S rDNA文庫分別含有 42、55、62和79個OTU, 通過Mothur軟件分析獲得文庫 Coverage值在 34.7%—54.8%之間,文庫序列樣品具有一定的代表性但未窮盡環(huán)境中細(xì)菌種類, 結(jié)合文庫稀釋度曲線從側(cè)面表現(xiàn)出刺參池塘養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌多樣性豐富。四個文庫樣品Shannon多樣性指數(shù)從 3.01—4.07變動, 特別是 PLc文庫4.07達(dá)到一個相當(dāng)高水平; Chao物種豐富度指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)也表明本研究的 4個樣本文庫細(xì)菌多樣性程度較高, 且PLt和PLc文庫明顯高于DYt和DYc樣品文庫, 蓬萊地區(qū)刺參育苗池中細(xì)菌多樣性均高于東營地區(qū)。東營刺參育苗池塘位于黃河三角洲地區(qū), 與蓬萊近海刺參養(yǎng)殖池塘的溫度、鹽度等生境環(huán)境因子有許多差異之處, 微生物群落功能特征與環(huán)境理化性質(zhì)緊密相關(guān)并相互限制影響(Gomezet al, 2006; 米亮等, 2010)。刺參育苗池細(xì)菌多樣性的變化對刺參養(yǎng)殖微生態(tài)調(diào)控及健康養(yǎng)殖模式的實(shí)施具有重要的指導(dǎo)意義, 微生物群落結(jié)構(gòu)是反映海水養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標(biāo)(Paerlet al,2003; Honget al, 2011), 蓬萊地區(qū)細(xì)菌多樣性均高于東營, 養(yǎng)殖地區(qū)環(huán)境微生物的差異性提示在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用生物絮團(tuán)技術(shù)需因地制宜, 對培養(yǎng)調(diào)控條件進(jìn)行微調(diào)。

3.2　生物絮團(tuán)細(xì)菌群落中優(yōu)勢菌群

黃桿菌綱(Flavobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和芽孢桿菌綱(Bacillus)是刺參苗種培育池中生物絮團(tuán)的主要優(yōu)勢菌群。黃桿菌綱細(xì)菌在東營和蓬萊地區(qū)四個樣本的克隆文庫中都有發(fā)現(xiàn), 且占比最大, 是刺參育苗水體中的絕對優(yōu)勢菌群。黃桿菌綱在刺參海水養(yǎng)殖環(huán)境中常被作為優(yōu)勢菌群檢出, 推測黃桿菌綱細(xì)菌可能為刺參養(yǎng)殖環(huán)境和腸道中的有益菌群(閆法軍, 2013)。α-變形菌群(Alphaproteobacteria)是第二大優(yōu)勢菌群, 其中α-變形菌亞綱是整個生物絮團(tuán)形成過程中特優(yōu)勢種類,夏耘等(2012)利用RF-DGGE技術(shù)和Zhao等(2012)利用bioflocs技術(shù)分析生物絮團(tuán)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)同樣獲得α-變形菌亞綱細(xì)菌是優(yōu)勢菌群的結(jié)果。α-變形菌綱細(xì)菌的豐度與初級生產(chǎn)力呈 U型相關(guān), 一般在富營養(yǎng)化海水環(huán)境中α-變形菌綱數(shù)量多意味著研究海域的初級生產(chǎn)力較高(Horner- Devineet al, 2003)。厚壁菌門中芽孢桿菌(Bacillus)為刺參養(yǎng)殖環(huán)境另一重要菌群, 芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細(xì)菌, 在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中可加速有機(jī)物的降解和轉(zhuǎn)化, 抑制弧菌的生長, 減少氨氮、亞硝基氮、硫化氫等有毒有害物質(zhì), 改善水質(zhì), 起到優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境的作用, 已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛認(rèn)可的一類有益微生物(林亮等, 2005; 楊鶯鶯等, 2009)。刺參苗種培育池中生物絮團(tuán)的功能作用與其微生物群落結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)勢菌群種類密切相關(guān)。

3.3　生物絮團(tuán)調(diào)控處理對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

生物絮團(tuán)的積極作用通過水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變來體現(xiàn)。對比經(jīng)過生物絮團(tuán)培育的處理組和對照組16S rDNA文庫, 蓬萊和東營地區(qū)對照組樣品的細(xì)菌多樣性均高于經(jīng)特殊生物絮團(tuán)調(diào)控的處理組樣品, 說明經(jīng)過生物絮團(tuán)調(diào)控技術(shù)改變了原有養(yǎng)殖環(huán)境生物群落結(jié)構(gòu), 優(yōu)勢細(xì)菌群落的生長抑制了一些其它種類, 細(xì)菌多樣性相對變小, 使微生物群落結(jié)構(gòu)趨向于穩(wěn)態(tài), 有利于控制細(xì)菌性疾病的爆發(fā)。利用DGGE技術(shù)研究日本囊對蝦(Marsupeneus japonicus)養(yǎng)殖過程中利用蔗糖作為碳源培養(yǎng)的生物絮團(tuán)細(xì)菌群落和對照組的差別, 研究者分析認(rèn)為生物絮團(tuán)調(diào)控技術(shù)改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu), 養(yǎng)殖水體內(nèi)因Bacillussp.的存在而有效抑制了病原菌(Zhaoet al, 2012)。優(yōu)勢菌群黃桿菌綱(Flavobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)細(xì)菌經(jīng)調(diào)控處理后其數(shù)量百分比分別有所增加和減少, 并且調(diào)控后樣品文庫出現(xiàn)了特有菌群ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria), 這種菌落組分的變化, 推測與碳源成分的添加使異養(yǎng)微生物數(shù)量變化有關(guān)(Crabet al, 2009)。經(jīng)添加枯草芽孢桿菌進(jìn)行生物絮團(tuán)培養(yǎng)后, DYt和PLt文庫芽孢桿菌數(shù)量達(dá)到較穩(wěn)定比例, 相關(guān)序列均占總文庫序列的11%左右, 其中蓬萊地區(qū)PLt組較PLc組文庫數(shù)量變化大, 調(diào)控效果明顯。

4　結(jié)語

生物絮團(tuán)作為微生物的集合體, 在生態(tài)系統(tǒng)的微生物循環(huán)和生態(tài)調(diào)控中起著重要作用, 目前微生物的宏基因組學(xué)成為研究微生物群落多樣性和動態(tài)變化的有效手段, 本研究利用16S rDNA文庫技術(shù)解析了不同地區(qū)生物絮團(tuán)的主要細(xì)菌群落組成, 對生物絮團(tuán)功能細(xì)菌種群組成、水質(zhì)改善、疾病控制和飼料價值的探討研究提供科學(xué)理論依據(jù)。在本研究對生物絮團(tuán)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群及特異菌群的認(rèn)知基礎(chǔ)上, 可結(jié)合目前對環(huán)境功能細(xì)菌特殊生理活性及細(xì)菌的群體行為調(diào)控機(jī)制研究, 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對生物絮團(tuán)微生物群落結(jié)構(gòu)和生物絮團(tuán)功能定向調(diào)節(jié),最終建立完善科學(xué)的生物絮團(tuán)技術(shù)體系, 廣泛推廣于水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用領(lǐng)域, 推動水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展。

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