曹偉麗，汪崇文，肖瑞，王升啟1，

1.安徽醫(yī)科大學，安徽 合肥 230031；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

食源性致病菌污染引起的疾病已成為世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)報道，美國每年有7600萬人身患食源性疾病，有5000致死病例；據(jù)2000年的報道，英國有130萬人患食源性疾病，有480個致死病例[1]。2006～2010年，我國衛(wèi)生機構(gòu)共收到食源性疾病暴發(fā)事件報告2023起，累計發(fā)病62920人，死亡967人，其中致病菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件數(shù)和患者數(shù)最多，分別占40.09%和61.92%[2]。它不但危及消費者健康和生命，而且對個人、單位和社會造成不同程度的經(jīng)濟損失，包括醫(yī)療費用、致殘而失業(yè)、勞動能力下降等。最常規(guī)最經(jīng)典的檢測方法如鋪板培養(yǎng)法[3]、生化檢測[4]等，操作過程較為繁瑣，而且非常耗時，難以滿足食源性疾病預(yù)防控制的需要。如何快速靈敏地檢測出食源性致病菌的存在，已成為控制食品安全問題的關(guān)鍵。

利用振動光譜如紅外光譜、拉曼光譜等技術(shù)檢測食源性致病菌早有研究。但紅外光譜對水非常敏感，不能充分發(fā)揮其檢測優(yōu)勢。拉曼光譜依賴于激發(fā)光的非彈性散射和分子間的振動產(chǎn)生指紋圖譜，以此來鑒別特定的待檢分子，具有快速檢測多種化學、生物物質(zhì)的能力，是一種可實時檢測的方法。而且水的拉曼效應(yīng)很弱，這使得拉曼光譜對水環(huán)境中的生物樣品檢測非常有效，另外拉曼特征峰比紅外特征峰要窄，拉曼光譜在較廣范圍的激光波長下能夠提供比紅外光譜更加具體和更易解讀的生物和化學信息。拉曼光譜的這些優(yōu)點使其常被用于微生物的檢測和表征[5-9]。但普通拉曼光譜信號弱，檢測靈敏度低，限制了其在食源性致病菌檢測中的發(fā)展。

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）以金屬納米結(jié)構(gòu)介導(dǎo)信號增強，相比普通拉曼光譜具有更高的分辨率和靈敏度，可實現(xiàn)高達1014倍的單分子拉曼信號增強，在低濃度分析物的檢測上更加有優(yōu)勢[10-11]。它是一種高靈敏的拉曼檢測技術(shù)，具體是指在特殊制備的一些貴金屬表面或溶膠中，由于樣品表面或近表面的電磁場的增強導(dǎo)致吸附分子的拉曼散射信號比普通拉曼散射信號大大增強（6～14個數(shù)量級）的現(xiàn)象。SERS能有效避免溶液相中相同物質(zhì)的信號干擾，具有極高的靈敏度和表面選擇性，能獲得高質(zhì)量的表面拉曼信號。SERS效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)后，很快在生物、醫(yī)學、材料、環(huán)境等方面得到廣泛應(yīng)用[12-14]。我們對目前國內(nèi)外食源性致病菌的SERS檢測方法進行歸納和綜述，并對不同方法的優(yōu)缺點進行闡述和分析。

1 食源性致病菌菌體檢測

1.1 無標記菌體檢測

無標記的SERS菌體檢測方法由于不需要特殊的檢測標記物如染料分子或化學發(fā)光分子等，檢測過程簡單快速。

1.1.1 納米金屬膠體菌體檢測 研究者大多通過不同大小的AuNP、AgNP等納米顆?；蛴蔁o機鹽誘導(dǎo)的納米顆粒團聚體作為SERS增強基底，簡單地與食源性致病菌混合而獲得其拉曼光譜。呂璞等[15]以整個大腸桿菌和志賀菌為研究對象，通過菌體與納米銀膠體混合均勻后滴于硅基底上，利用拉曼光譜儀檢測其拉曼信號來區(qū)分大腸桿菌和志賀菌。結(jié)果表明，未與納米銀顆?；旌系拇竽c桿菌和志賀菌沒有明顯的拉曼信號，而與納米銀顆粒混合后有明顯的拉曼信號，二者有明顯的區(qū)別，且重現(xiàn)性良好。蘇永波等[16]用便攜式拉曼光譜儀獲得了金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌在微波法制備的納米銀溶膠上的表面增強拉曼光譜。3種細菌的拉曼振動峰的位置和強度區(qū)別明顯，因此SERS技術(shù)可用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌的快速鑒別。根據(jù)SERS的增強效應(yīng)，黃玉坤等[17]制備金納米溶膠作為增強試劑，采用36種不同的病原菌隨機編號作為未知樣品進行拉曼光譜掃描檢測，通過聚類分析達到種屬鑒別，初步建立了病原菌SERS快速鑒別方法。

Senguptaa等[18]以納米銀膠體為SERS基底，對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門菌進行了鑒別，并通過對含有N-乙?；陌被咸烟呛蛶О被腖-賴氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酸進行檢測，初步分析了致病菌拉曼峰歸屬問題。Wang等[19]在96孔板中以50 nm AuNP為SERS基底，通過與菌體混合、短暫培養(yǎng)，5 min內(nèi)檢測菌體的拉曼信號，所得數(shù)據(jù)用PCA、HCA軟件分析后，對7種不同的致病菌進行了區(qū)分歸類。Yao[20]以AuNP為SERS基底，對9種致病菌進行了SERS檢測，PCA和HCA分析實現(xiàn)了歸類。SERS技術(shù)與數(shù)學分析方法結(jié)合，增強了其檢測食源性病原菌的實用性及靈敏性，應(yīng)用潛力很大。

為了提高菌體檢測的靈敏度及重復(fù)性，楊丹婷等[21]以大腸桿菌DSM株為檢測模型、膠體銀為液態(tài)基底，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件（振蕩速度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度），選取較優(yōu)條件對培養(yǎng)的大腸桿菌進行檢測。DSM 1116在制備的AgNP溶液中于37℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)3 h為獲得SER檢測的較優(yōu)培養(yǎng)條件。以此條件，通過對檢測結(jié)果歸一化處理，對大腸桿菌DSM 498/1116/5695進行了鑒別。另外還檢測出單個大腸桿菌的拉曼峰，其出峰位置與溶液中細菌的出峰位置相同。通過SERS成像技術(shù)能夠檢測到大腸桿菌的最低濃度為1×105/mL。這種在膠體銀中培養(yǎng)后檢測的方法比未培養(yǎng)的檢測方法的拉曼信號強度提高到3.5倍，靈敏度和重復(fù)性也得到提升。

上述以金屬膠體為SERS基底檢測致病菌的方法簡單、快速、成本低，不需要特殊裝備，但結(jié)果重復(fù)性差。納米顆粒與細菌的混合溶液往往不均一[22]，金屬膠體的形狀、大小的微小變化都可以改變其SERS增強因子，且納米顆粒與致病菌細胞壁之間不充分的結(jié)合常常得不到重復(fù)性好的拉曼光譜，這在一定程度上限制了SERS技術(shù)的應(yīng)用。

1.1.2 固態(tài)基底菌體檢測 為了提高SERS檢測致病菌方法的重復(fù)性，很多研究者研制固態(tài)基底對致病菌進行檢測。2009年，波士頓大學的Yan等[23]通過在電場力作用下，以10 nm Au和40 nm Au自組裝制備固態(tài)基底，對大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌進行了檢測。通過多元方差、NCAS等對數(shù)據(jù)進行分析，實現(xiàn)了對這3種菌的鑒別。

Zhao[24]帶領(lǐng)他的團隊利用斜角沉積技術(shù)，用專門設(shè)計的電子波束蒸鍍系統(tǒng)制備了銀基底。他們使用便攜式和手持式拉曼光譜儀，以萬古霉素修飾的銀基底檢測了致病菌。純菌體樣本的最低檢測限為102CFU/mL，綠豆芽樣本的最低檢測限為103CFU/mL。另外，該課題組結(jié)合數(shù)學分析方法，通過主成分分析，對不同菌株進行了區(qū)分，整個實驗周期少于4 h。這種方法提供了SERS檢測微量食源性致病菌的有力平臺，同時具有在實際環(huán)境中應(yīng)用的潛力，為SERS技術(shù)的推廣應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

1.2 抗體標記法菌體檢測

1.2.1 單組抗體標記檢測 2010年，Wigginton等[25]通過膠體金標記一組抗體的方法得到待測菌的拉曼信號。他們將含有致病菌的樣品用膜濾器過濾，并捕獲在膜的頂部；以40 nm膠體金標記抗體，與待檢溶液孵育30 min。標記抗體的膠體金與待檢菌特異性結(jié)合，然后通過PCTE膜過濾，清洗后，未與抗體結(jié)合的致病菌被洗掉，結(jié)合了膠體金的待檢菌通過拉曼成像檢測。這種方法檢測特異性高，能從含有多種菌體的樣本中分離出待檢菌。但是由于蛋白質(zhì)的空間位阻，使得膠體金與待檢菌距離加大，其SERS增強作用減弱，使得檢測靈敏度較低。

1.2.2 雙組抗體標記檢測 為提高檢測靈敏度，許多研究采用抗體-抗原-抗體夾心法結(jié)合SRRS技術(shù)檢測致病菌。首先拉曼復(fù)合物偶聯(lián)抗體后特異性捕獲樣品中的致病菌，然后與連有抗體的液態(tài)基底結(jié)合，拉曼光譜儀檢測拉曼信號。在利用SERS抗原抗體夾心法檢測致病菌方面，Wang、Guven等做了很多研究，并取得了一定的成果。Wang等以二氧化硅包裹順磁性納米顆粒Fe3O4為液態(tài)基底、納米Au-MBA為拉曼復(fù)合物，檢測了花生液中的3種致病菌，最低檢測限為103CFU/mL[26]。Guven等以棒狀金膠體結(jié)合DTNB為拉曼復(fù)合物、金包裹順磁性納米顆粒Fe3O4為液態(tài)基底，檢測DTNB的拉曼信號。檢測了濃度為101～107CFU/mL的大腸桿菌，在4.7×101～4.7×104CFU/mL范圍內(nèi)拉曼信號強度與菌體濃度有良好的線性關(guān)系，R2為0.992。最低檢測限（LOD）為8 CFU/mL，定量限（LOQ）為24 CFU/mL[27]。這種方法基于抗原抗體免疫反應(yīng)，特異性好；同時由于拉曼標志物的信號較菌體本身信號強，在外加磁場作用下納米顆粒Fe3O4對待檢物進行有效富集，故可獲得較高的檢測靈敏度。但是由于需要能特異性與致病菌反應(yīng)的一對抗體，這種方法的檢測成本較高，偶聯(lián)抗體等步驟使得前期實驗過程繁瑣，且由于蛋白存放周期的限制，其應(yīng)用有效期較短，且偶聯(lián)抗體后的拉曼復(fù)合物穩(wěn)定性仍有待提高。

2 食源性致病菌標記物檢測

吡啶二羧酸（DPA）是致病菌的休眠體-芽孢中特有的生物標記物。通過檢測DPA，可實現(xiàn)對致病菌芽孢的檢測[28]。2009年，Cheng等[29]利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）修飾金基底，然后在PVP上面修飾一層金納米顆粒作為SERS基底檢測DPA，最低檢測限為0.1×10-9mol/L，而且在低濃度范圍內(nèi)DPA的拉曼信號強度和它的濃度之間呈線性相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為建立高靈敏度的基于SERS對致病菌孢子生物標志物進行識別的技術(shù)提供了很好的研究基礎(chǔ)。2年后，該課題組利用金納米顆粒作為SERS基底檢測枯草芽孢桿菌孢子釋放的DPA[30]。該方法讓SERS檢測致病菌孢子具有更高的分辨率和靈敏性。2013年，Cowcher小組[31]以銀納米溶膠作為SERS基底，結(jié)合數(shù)學分析方法，建立了一套便攜式快速檢測病菌的檢測系統(tǒng)，可檢測5×10-9DPA。

與直接檢測完整菌體相比，檢測致病菌孢子標記物具有更高的分辨率和靈敏性，這在檢測環(huán)境中是否存在致病菌時具有很好的實用性。但是由于DPA是致病菌孢子中共有的物質(zhì)，所以通過檢測DPA無法實現(xiàn)對不同菌株的鑒別與區(qū)分。

3 食源性致病菌核酸檢測

2010年韓國的Kang等[32]以4種致病菌的目的DNA片段為待檢物，設(shè)計了2條與目的DNA片段互補配對的DNA探針，將其中一條通過巰基固定在普通硅基底上作為捕獲探針，用拉曼染料、AuNP與另一條DNA序列相連作為檢測探針，其中AuNP起SERS增強作用，增強因子為2.6×103。該方法的最低檢測濃度為10 pmol/L。

這種檢測方法靈敏度很高，但在實際應(yīng)用中可行性不高。首先，須從菌體中提取核酸，樣品前處理過程繁瑣；其次，基于SERS檢測食源性致病菌核酸的主要工作是制作與目標寡核苷酸互補的檢測寡核苷酸探針和捕獲寡核苷酸探針，而設(shè)計探針需要目的DNA片段的堿基序列，這就限制了此方法的實際應(yīng)用，且偶聯(lián)核酸等實驗過程較為繁瑣，周期較長。

4 SERS與其他技術(shù)聯(lián)用

SERS與其他技術(shù)連用，是為了取長補短，實現(xiàn)致病菌檢測方法的優(yōu)化。2003年，Alexander等[33]采用近紅外-SERS獲得單一細菌孢子的拉曼光譜。他們把60 nm AuNP修飾在玻璃上作為SERS基底，在787 nm激光激發(fā)下，對嗜熱芽孢桿菌的2種不同菌株的單個孢子進行了檢測，與傳統(tǒng)拉曼光譜相比，靈敏度增強了102。

5 結(jié)語

由于食源性致病菌在數(shù)百萬細菌中只占很少的一部分（＜100 CFU/g），尤其當它們濃度較低時，很難被檢測出來[34]。這就需要開發(fā)穩(wěn)定、可靠、快速、靈敏、有選擇性及成本可行的檢測技術(shù)。這種檢測技術(shù)應(yīng)該能夠適合實時監(jiān)測，以滿足實際應(yīng)用中食源性疾病預(yù)防控制的需要。根據(jù)SERS技術(shù)的理論及應(yīng)用實踐，人們已建立了很多快速、簡便、特異、敏感、低耗的SERS檢測技術(shù)。但是，目前仍未能實現(xiàn)SERS檢測技術(shù)的產(chǎn)品化與廣泛推廣應(yīng)用，各項研究仍須進一步完善與優(yōu)化。

近年來SERS技術(shù)發(fā)展迅速，隨著微加工技術(shù)和納米技術(shù)的進步，拉曼光譜儀將不斷微型化，各種便攜式、手持式拉曼光譜儀的出現(xiàn)，使在市場上直接檢測食源性致病菌成為可能。拉曼光譜儀還將進一步提高與計算機的緊密結(jié)合，樣本信息采集、數(shù)據(jù)處理、分析連續(xù)完成，形成檢測的自動化系統(tǒng)。SERS技術(shù)的不斷進步，必然會要求不斷降低檢測成本，提高靈敏度、穩(wěn)定性，這些特性的改善也會加速這項致病菌檢測技術(shù)的市場化、商品化應(yīng)用進程。

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