杜祥博，周寧，孫博，張琪，許美鳳，顏賢忠

1.中南大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850

隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人們關(guān)注的焦點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向系統(tǒng)生物學(xué)，作為系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等先后發(fā)展起來(lái)。無(wú)論機(jī)體在基因、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄層面發(fā)生什么變化，最終都會(huì)體現(xiàn)在代謝產(chǎn)物的變化上?？梢哉f代謝組是對(duì)基因組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組層面變化的一種“放大”，這種變化可以敏銳地體現(xiàn)在代謝產(chǎn)物的變化上，即反映機(jī)體在特定生理病理狀態(tài)下的變化，從而為疾病的診斷提供新的研究思路。目前隨著各組學(xué)學(xué)科的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)也成為研究熱點(diǎn)之一，其在各個(gè)方面的應(yīng)用日益深入，如毒理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、疾病診斷等。我們結(jié)合代謝組學(xué)概況，對(duì)其近年來(lái)在幾種呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物研究方面取得的進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介

代謝組學(xué)概念最早是由英國(guó)學(xué)者Nicholson等[1]在1999年基于核磁共振（NMR）分析的基礎(chǔ)上首次提出的,并將其定義為通過分析生物體液和組織中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物、代謝組或代謝物圖譜的變化來(lái)研究整體的生理狀況，是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要分支學(xué)科。隨著生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)代謝組學(xué)的認(rèn)識(shí)也不斷深入，代謝組學(xué)研究就是要利用各種高通量的分析手段，對(duì)生物體液、細(xì)胞及其提取物和組織及其提取物進(jìn)行系統(tǒng)分析，找出相關(guān)的生物標(biāo)志物，闡述相關(guān)的代謝路徑，對(duì)機(jī)體整體的狀況和功能做出評(píng)價(jià)，進(jìn)而探討其應(yīng)用于疾病診斷的可行性。常用的檢測(cè)技術(shù)主要有核磁共振、色譜、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等。代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析多采用模式識(shí)別技術(shù)，主要包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法（OPLS-DA）等，結(jié)合代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，挖掘出這些數(shù)據(jù)中蘊(yùn)含的生物學(xué)信息，闡明其相關(guān)的代謝通路。

2 代謝組學(xué)在呼吸系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用

呼吸系統(tǒng)疾病一直是危害人體健康的常見疾病，哮喘、慢性阻塞性肺病、囊性纖維化、肺結(jié)核、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率都呈逐年上升趨勢(shì)。隨著我國(guó)工業(yè)化的不斷深入，空氣質(zhì)量日益惡化，特別是近年來(lái)霧霾天氣頻繁出現(xiàn)，其對(duì)人體呼吸系統(tǒng)的危害日益嚴(yán)重，有關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病的代謝組學(xué)研究已成為科研工作者關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。

2.1 哮喘

哮喘是人類常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，易于反復(fù)發(fā)作，極大地降低患者生存質(zhì)量，特別易發(fā)于兒童，近些年來(lái)已成為人們關(guān)注的全球性健康問題。盡管鏡檢是較為直接的檢查方式，但鏡檢價(jià)格昂貴且病人生理上較難接受，因而尋找一種簡(jiǎn)單非侵襲性的診斷方式成為人們關(guān)注的問題。Sude等[2]收集了穩(wěn)定型哮喘兒童患者、不穩(wěn)定型哮喘兒童患者和健康兒童的尿液，采用NMR技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果分別找出23和28種潛在的生物標(biāo)志物，并以其中的30種代謝物建立模型，能夠?qū)⒎€(wěn)定型、不穩(wěn)定型哮喘兒童與健康兒童區(qū)分開來(lái)。Mattarucchi等[3]采用LC-MS的代謝組學(xué)方法，對(duì)41例哮喘兒童和12例健康兒童的尿液進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示兩者有較明顯的分離趨勢(shì)，相對(duì)于對(duì)照組，患者組尿液中乙酸鹽、異亮氨酸-脯氨酸結(jié)構(gòu)類似物排泄減少。上述研究均表明，基于尿液的代謝組學(xué)研究可為哮喘的診斷和分型提供較為可靠的方法。Gahleitner等[4]采用GC-MS技術(shù)研究哮喘患者和健康人的呼出氣冷凝液，發(fā)現(xiàn)患者組呼出氣冷凝液中1，4-二氯苯、2-辛烯醛、十八炔和乙酰膽堿等物質(zhì)水平顯著性升高。Ibrahim等[5]采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)研究哮喘病人和健康人的呼出氣冷凝液，尋找兩者間代謝物的顯著性差異，但是通過82例哮喘患者和35例健康人的NMR數(shù)據(jù)分析并沒有能夠找出潛在的生物標(biāo)志物。Jung等[6]則采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)研究了39例哮喘患者和26例健康志愿者的血漿樣品，發(fā)現(xiàn)病人組組氨酸、谷氨酰胺等代謝物水平升高，乙酸、葡糖糖、膽堿等水平顯著性升高。

Ho等[7]采用GC-MS和LC-MS技術(shù)結(jié)合的方法研究小鼠哮喘模型。研究結(jié)果顯示，哮喘模型組和對(duì)照組的差異主要表現(xiàn)在碳水化合物和脂類物質(zhì)的差異，如乳酸、肌酐等水平降低，半乳糖等水平升高；脂類中的磷脂酰膽堿、甘油三酯、膽固醇等代謝物水平升高。Ho等[8]將氣質(zhì)液質(zhì)的代謝組學(xué)方法與多重細(xì)胞因子分析結(jié)合起來(lái)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在塵螨暴露環(huán)境中嗜酸性粒細(xì)胞增多，中性粒細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子增加。總的來(lái)說，代謝組學(xué)較為全面地揭示了塵螨引起的過敏性哮喘的特異性變化。近期的研究將代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合起來(lái)，發(fā)現(xiàn)磷脂酰膽堿水平升高和溶血磷脂酰膽堿水平下降是哮喘的代表性代謝模式，同時(shí)也對(duì)之前的研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證和補(bǔ)充。

2.2 慢性阻塞性肺?。–OPD）

COPD具有患病人數(shù)多、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和治療難度大的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，COPD目前居全球死亡原因的第4位，預(yù)計(jì)到2020年COPD將上升到世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的第5位，而我國(guó)COPD的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人民身體健康。有證據(jù)顯示COPD病人骨骼肌內(nèi)能量代謝紊亂，為此Rodriguez等[9]收集了18例COPD患者和12例健康志愿者運(yùn)動(dòng)前后的血漿，用NMR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)兩者前后變化差異較大，正常人多種氨基酸、肌酐/肌酸、葡萄糖等代謝物表現(xiàn)出顯著性的變化，而COPD患者在訓(xùn)練后只有乳酸水平的下降。該研究也證明代謝組學(xué)可以較好地表征COPD患者體內(nèi)的變化。

Mcclay等[10]通過NMR的代謝組學(xué)方法，研究了195例健康人和197例COPD患者的血漿和尿液小分子代謝物譜，結(jié)果顯示尿液代謝物中葫蘆巴堿、馬尿酸鹽和甲酸鹽水平的變化與COPD相關(guān)，而血漿代謝物譜未顯示顯著性的差異。Bertini等[11]采用NMR技術(shù)檢測(cè)了COPD病人和健康志愿者的呼吸冷凝液和唾液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在去除唾液的影響后，病人組丙酮、丙氨酸和賴氨酸水平顯著降低，而乳酸、絲氨酸、酪氨酸等代謝物水平明顯升高。各個(gè)模型的診斷效力不一，須在更大量樣品中去驗(yàn)證，但現(xiàn)有研究成果顯示基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)具有在疾病快速診斷與鑒別診斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值。Paige等[12]通過檢測(cè)不吸煙的正常人、吸煙的非肺氣腫和吸煙的肺氣腫患者的血漿小分子代謝物，從檢測(cè)到的幾百種代謝物中篩選出了12種差異性代謝物，并從中選取7種代謝物建立模型，模型的預(yù)測(cè)效率近80%。Ubbi等[13]采用LC-MS技術(shù)獲取了COPD病人、胰腺癌病人和正常人血漿中氨基酸類等多種代謝物的信息，找到了COPD患者區(qū)別于正常人的潛在差異代謝物，發(fā)現(xiàn)COPD患者血漿中極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、二甲胺的水平有所下降，而苯丙氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和酮體類代謝物水平顯著下降。上述研究也表明代謝組學(xué)能夠較好地體現(xiàn)出COPD病人較為特殊的氨基酸等各類型代謝體系，具有潛在的應(yīng)用于早期臨床診斷的價(jià)值。

2.3 囊性纖維化

囊性纖維化嚴(yán)重?fù)p害肺功能，隨著肺部疾病及肺功能損害的加重，進(jìn)一步導(dǎo)致右心肥大、心力衰竭等更嚴(yán)重的并發(fā)癥。Montuschi等[14]采用基于NMR的代謝組學(xué)方法，研究了穩(wěn)定型、不穩(wěn)定型囊性纖維化病人和健康人的呼出氣冷凝液和唾液。結(jié)果顯示冷凝液譜圖和唾液譜圖差異性很大，可排除唾液對(duì)呼出氣冷凝液的污染，與健康對(duì)照組相比，穩(wěn)定型囊性纖維化病人組冷凝液中乙酸和乙醇含量較低，異丙醇和丙酮等小分子代謝物含量較高；與不穩(wěn)定型病人組相比，乙醇和異丙醇的含量相對(duì)較高，甲醇和乙酸含量相對(duì)較低。另一項(xiàng)研究中，Yang等[15]收集病人和健康人的痰液，并對(duì)痰液提取后采用LC-MS進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)痰液含有包括前列腺素、血栓素、白三烯等大量促炎性和抗炎性氧脂素，同時(shí)白三烯類與呼氣容量呈負(fù)相關(guān)，亞油酸、血栓素等與呼氣容量呈正相關(guān)。Joseloff等[16]對(duì)囊性纖維化病人和非囊性纖維化病人的血漿進(jìn)行研究，從中找出92種有顯著性差異的小分子代謝物，包括較低水平的3-羥基丁酸、中鏈肉堿、谷胱甘肽和較高水平的二羧酸類物質(zhì)。細(xì)胞能量代謝的紊亂也反映了線粒體功能和膽汁酸代謝的紊亂，同時(shí)細(xì)菌代謝產(chǎn)物也發(fā)生了相應(yīng)的變化，表明腸道菌群也出現(xiàn)了失調(diào)的情況。從上述研究中可以看出，人們正在積極運(yùn)用代謝組學(xué)等新手段來(lái)尋找囊性纖維化的潛在生物標(biāo)志物。

2.4 肺結(jié)核

現(xiàn)階段結(jié)核病已成為嚴(yán)重威脅人類生存的三大疾病殺手之一。肺結(jié)核是最常見的結(jié)核病，有關(guān)結(jié)核病的代謝組學(xué)研究也日漸受到研究者的關(guān)注，并取得了一些研究成果。如Shin等[17]建立了結(jié)核桿菌感染大鼠模型和健康對(duì)照模型，用NMR代謝組學(xué)方法對(duì)模型組織和血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)核感染模型糖酵解、氨基酸代謝、磷脂代謝等均發(fā)生明顯異常。Bagganahalli等[18]基于NMR和多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)對(duì)結(jié)核桿菌感染的豬模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽等一批差異性代謝物，同時(shí)也證明基于NMR的代謝組學(xué)方法能夠預(yù)測(cè)結(jié)核病的發(fā)展過程，具有作為未來(lái)快速診斷技術(shù)的潛力。Feng等[19]通過UPLC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)核病人和健康人的血漿進(jìn)行檢測(cè)，觀察到疾病組血漿中溶血磷脂酰膽堿、谷氨酸等代謝產(chǎn)物含量發(fā)生顯著性變化，并能很好地將疾病組和對(duì)照組區(qū)分開。Weiner等[20]通過研究健康人、已感染但未發(fā)病的人和已發(fā)病人的血清的代謝組學(xué)，從代謝物譜圖上觀察到氨基酸類、核酸類和脂質(zhì)類代謝通路發(fā)生了變化，結(jié)核病人組吲哚胺2，3-雙加氧酶1活性顯著升高。該研究也為結(jié)核病生物標(biāo)志物的開發(fā)探索了一條新的方向。Che[21]等采用GC-MS的代謝組學(xué)方法研究了結(jié)核病人和健康志愿者的血清，結(jié)果顯示結(jié)核病人血清中5-氧脯氨酸均處于較低水平，并進(jìn)一步在大量結(jié)核病人中進(jìn)行了驗(yàn)證，表明5-氧脯氨酸可能是一個(gè)肺結(jié)核和肺病理?yè)p傷的生物標(biāo)志物。Chen等[22]基于NMR技術(shù)來(lái)研究不同菌株對(duì)牛的感染能力，發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核桿菌和人結(jié)核桿菌對(duì)牛都有感染能力，并且感染后的牛有將結(jié)核桿菌傳染給人的能力，NMR技術(shù)能區(qū)分出不同菌株感染的牛。Zhou等[23]用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)和OPLS-DA模型，分析來(lái)自肺結(jié)核病患者和健康志愿者的血樣，篩選出了乙酰乙酸、丙酮等17種潛在生物標(biāo)志物，進(jìn)一步證明代謝組學(xué)技術(shù)可以作為臨床診斷肺結(jié)核病的潛在技術(shù)手段，并為闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制提供技術(shù)支持。

2.5 肺癌

肺癌患者中男性占據(jù)很大比重，且年齡多數(shù)在40歲以上。吸煙和肺癌的關(guān)系已在多個(gè)國(guó)家進(jìn)行過調(diào)查，結(jié)果均表明吸煙與肺癌有著較為密切的關(guān)系。此外，其他因素如空氣污染、職業(yè)性致癌因素和遺傳因素等也都可能導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。我國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，已成為影響居民健康的主要惡性腫瘤之一。

Rocha等[24]采用NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)肺癌患者和健康志愿者的血漿進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肺癌組血漿中高密度脂蛋白水平較低，極低密度脂蛋白水平較高，丙酮酸和乳酸的含量升高，而檸檬酸、葡萄糖及多種氨基酸類代謝物含量降低。研究還發(fā)現(xiàn)，上述變化在疾病初始階段即有，可能與癌癥生化進(jìn)程相關(guān)，這對(duì)于研究其相關(guān)的代謝通路有重要意義。Ho?ri等[25]對(duì)健康人和肺癌患者的血清樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，結(jié)果顯示23種內(nèi)源性代謝物發(fā)生了顯著性變化，不同階段的肺癌患者體內(nèi)代謝物表現(xiàn)出特征性的變化。另外，對(duì)肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中多種代謝物發(fā)生了顯著性變化。Carrola等[26]采用1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)肺癌患者和健康志愿者的尿液進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者尿液中馬尿酸鹽和葫蘆巴堿含量降低，而谷氨酰胺等代謝物相對(duì)對(duì)照組水平升高。Fan[27]等利用13C同位素標(biāo)記代謝組學(xué)方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示腫瘤組織與癌旁正常組織相比，丙氨酸、乳酸等代謝物水平有顯著性變化，提示癌組織中糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝活躍。牛艷杰等[28]采用GC-MS的代謝組學(xué)方法對(duì)19例肺癌患者和15例其他肺部疾病患者的血清及尿液樣本進(jìn)行分析，并采用正交偏最小二乘判別分析法建立模型，經(jīng)過多變量統(tǒng)計(jì)分析和t檢驗(yàn)找出潛在的差異性代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示兩組有較明顯的分離趨勢(shì)，找到乳酸、丙酮酸、檸檬酸等13種血清相關(guān)差異代謝物，肌酐、核苷酸等7種尿液相關(guān)差異代謝物，為在分子水平輔助診斷肺癌提供了參考。Duarte[29]等采用1H-NMR代謝組學(xué)方法對(duì)22例COPD患者和77例不同階段的肺癌患者的血漿進(jìn)行研究，經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)分析并建立OPLSDA模型，該模型能夠非常明顯地將COPD患者組和各期肺癌患者組分離開來(lái)，相對(duì)于COPD患者，肺癌組乳酸、檸檬酸、甲醇等代謝物水平下降，亮氨酸、賴氨酸、脂類等水平升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)異亮氨酸、肌酐和甘油等可能與肺癌疾病進(jìn)程相關(guān)。Li等[30]使用超高液相質(zhì)譜技術(shù)對(duì)收集到的肺癌患者和健康志愿者的血漿進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，通過多元統(tǒng)計(jì)分析建立模型，結(jié)果顯示兩組有明顯的分離趨勢(shì)，檢測(cè)出的差異代謝物大部分與脂代謝相關(guān)。上述研究證明了代謝組學(xué)技術(shù)在肺癌等疾病研究中有著巨大應(yīng)用價(jià)值，為肺癌診斷方法的建立提供了一個(gè)新的研究方向，同時(shí)也可以為其相關(guān)代謝機(jī)制的研究提供一些技術(shù)上的支持。

3 結(jié)語(yǔ)

上述研究結(jié)果顯示代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⑦@些呼吸系統(tǒng)疾病患者組和對(duì)照組區(qū)分開，并找到了一些潛在的生物標(biāo)志物，但是目前還沒有真正的生物標(biāo)志物應(yīng)用到現(xiàn)實(shí)診斷當(dāng)中。因?yàn)闈撛诘纳飿?biāo)志物到真正的生物標(biāo)志物及其相關(guān)的代謝通路和調(diào)節(jié)機(jī)制的闡明依然有很長(zhǎng)的一段距離。當(dāng)然這不僅需要科研工作者的努力，還需要臨床醫(yī)生、病人及其家屬的積極配合。代謝組學(xué)技術(shù)經(jīng)過十多年的發(fā)展雖然已經(jīng)有了較為明顯的進(jìn)步，但還有很多工作要完善，同時(shí)我們還應(yīng)將作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分的各種組學(xué)技術(shù)綜合利用起來(lái)，這樣代謝組學(xué)技術(shù)將能在疾病的診斷及疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡明中發(fā)揮更大的作用。

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