李智超++李琳玲++程華++程水源

摘要：為探究適宜豆腐柴（Premna microphylla Turcz）細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件，以豆腐柴葉片為材料，進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、愈傷組織分散、懸浮培養(yǎng)的研究，建立了搖瓶懸浮培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，豆腐柴葉片誘導(dǎo)得到的愈傷組織形態(tài)各異，其中誘導(dǎo)最適合懸浮培養(yǎng)的松散型胚性愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂。通過(guò)纖維素酶和果膠酶分散愈傷組織塊可以得到較好的分散細(xì)胞系，最適合懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基條件為MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT+3%蔗糖，其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞鮮重增加量平均每7 d可達(dá)6.46倍，暗培養(yǎng)相對(duì)更適合細(xì)胞的增殖。經(jīng)最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)21 d的豆腐柴懸浮細(xì)胞中果膠和蛋白質(zhì)平均含量達(dá)6.57%和0.12%，遠(yuǎn)低于豆腐柴天然葉片中的含量。

關(guān)鍵詞：豆腐柴（Premna microphylla Turcz）；愈傷組織；懸浮細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R282；Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0171-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.043

Embryoid Induction and Cell Suspension Culture of Premna microphylla Turca

LI Zhi-chao1，LI Lin-ling1，2，CHENG Hua1，2，CHENG Shui-yuan1，2

（1. College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei，China；2.Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratory， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： In order to find the suspension culture conditions of Premna microphylla Turca，the leaf blades of the experimented Premna microphylla Turca，induced embryogenic callus and subculture，which established a good dispersion and a high dynamic suspension cell line. The results showed that the callus induction from leaves were different. Which induces the most suitable medium for suspension culture of loose embryogenic callus contained MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L NAA+3% sucrose+0.8% agar. Cell lines can be dispersed better by cellulase and pectinase dispersed callus block. The most suitable medium for suspension cell growth contains MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT+3% sucrose. And in this medium，the fresh weight of the suspension cultured cells could be increased by 6.46 times per 7 days. Dark culture was more suitable for cell proliferation. The average contents of pectin and protein were 6.57% and 0.12% in the suspended cells of Premna microphylla Turca，which had been cultured for 3 weeks under the optimum culture conditions.

Key words： Premna microphylla Turcz； callus； suspension culture

豆腐柴（Premna microphylla Turcz）又名臭黃荊、豆腐木、腐婢等，為馬鞭草科豆腐柴屬落葉直立灌木[1]。其葉片具有豐富的果膠，含量可達(dá)39.5%，酯化度73%～78%，可以作為優(yōu)良的果膠提取原料[2]。此外，豆腐柴葉片中粗蛋白含量高達(dá)29.0%～34.1%，在目前已知植物中名列前茅；其根莖部含有木栓酮、木栓醇、十八碳酸、甾醇、胡蘿卜甙、柚皮素、香草酸等多種藥用成分[3，4]，被用于中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)治療皮膚傷口、感染、瘧疾、痢疾、頭痛和毒蛇咬傷等[4]。

目前，豆腐柴主要通過(guò)野外采集獲得，由于野生條件下豆腐柴零星散布在海拔500～1 500 m向陽(yáng)山坡疏林下、林緣、溝谷邊、荒山、丘陵、灌木層中[3，4]，難以滿足生產(chǎn)需要。此外，其生長(zhǎng)緩慢，種子自然態(tài)萌發(fā)率低。因此，豆腐柴的繁殖和人工栽培尤為重要。關(guān)于這類野生藥食用植物的人工繁育研究進(jìn)展緩慢。房江育等[5]、李琳玲等[6]、劉世彪等[7]分別對(duì)豆腐柴扦插和水培生根進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)。程華等[8]、程水源等[9]探討了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)豆腐柴愈傷組織誘導(dǎo)的影響。而關(guān)于豆腐柴細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系構(gòu)建的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)豆腐柴疏松愈傷組織誘導(dǎo)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行研究，分析誘導(dǎo)疏松的、適合進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的豆腐柴愈傷組織的最適培養(yǎng)基及豆腐柴細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的適宜條件，以期為通過(guò)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)豆腐柴果膠或次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料采自湖北省羅田縣大別山區(qū)野生豆腐柴的新鮮植株。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 從豆腐柴枝中上部剪取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病、蟲害的嫩葉，用流水沖洗后再用去離子水浸泡沖洗干凈，置于超凈臺(tái)上無(wú)菌風(fēng)吹干，用70%乙醇消毒30 s，0.1%升汞消毒數(shù)分鐘，無(wú)菌水沖洗5～6次，每次1 min，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面水分。

將消毒處理好的葉片用解剖刀切成0.5～1.0 cm2的小葉盤，接種于MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂。（24±2） ℃下進(jìn)行14 h 2 000 lx光照+10 h黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 懸浮培養(yǎng)分散細(xì)胞制備 分別采取機(jī)械分散法和消化分離法分散愈傷組織細(xì)胞。

機(jī)械分散法：將繼代3次的愈傷組織用解剖刀切碎，再用無(wú)菌玻璃棒攪拌使其分散，經(jīng)無(wú)菌80目網(wǎng)篩過(guò)濾后即為分散培養(yǎng)細(xì)胞。

消化分離法：選取生長(zhǎng)旺盛，繼代3次的愈傷組織約2.0 g，接種于細(xì)胞分散培養(yǎng)基MS液體培養(yǎng)基+0.04 mg/mL纖維素酶+0.04 mg/mL果膠酶中，24 ℃，120 r/min懸浮振蕩培養(yǎng)2 d后，無(wú)菌80目網(wǎng)篩過(guò)濾即得分散培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞懸浮體系優(yōu)化設(shè)計(jì) 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)采取以MS+5%蔗糖+350 mg/L水解酪蛋白為基本培養(yǎng)基，加上不同濃度配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（表1）。用150 mL三角瓶懸浮培養(yǎng)豆腐柴愈傷組織細(xì)胞，取每瓶50 mL液體培養(yǎng)基進(jìn)行接種。

將接種液接種于含有不同激素的MS液體培養(yǎng)基中（表1），置于24 ℃、24 h 2 000 lx光照或24 h黑暗條件下，120 r/min懸浮振蕩培養(yǎng)。7 d繼代1次，連續(xù)繼代2～3次，將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物用80目鎳網(wǎng)過(guò)濾，濾液分裝后繼續(xù)培養(yǎng)，作為起始懸浮培養(yǎng)液。每隔3 d取3瓶細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心（5 000 r/min，10 min）后，于60 ℃烘干，測(cè)定細(xì)胞干重。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 用解剖針挑取少量愈傷組織細(xì)胞于載玻片上，加一滴醋酸洋紅染色液（細(xì)胞核染色用I-KI溶液），用鑷子將組織搗碎，蓋上蓋玻片，輕壓蓋玻片至愈傷組織均勻分散，然后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 懸浮細(xì)胞果膠提取及含量測(cè)定 用孔徑為100目的鋼絲篩去掉細(xì)胞培養(yǎng)液留下懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，冷凍干燥后，用研缽粉碎，倒進(jìn)50 mL燒杯中，再加入0.1 mol/L HCL 20 mL。微熱攪拌30 min后，減壓抽濾。濾液用2倍體積的95%乙醇沉淀，所得沉淀物呈透明、泡沫、膠狀；將濾液裝入分液漏斗進(jìn)行分離，得到果膠后，使乙醇在空氣中自然揮發(fā)，至質(zhì)量恒定后，稱重。

1.2.6 懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)提取及含量測(cè)定 用孔徑為100目的鋼絲篩去掉細(xì)胞培養(yǎng)液留下懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，利用紫外吸收法測(cè)定懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。具體方法：用5 mL去離子水研磨成勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL于試管中。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度，用0.1 mol/mL pH 7.0磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋，分別稀釋成10倍、20倍和100倍3種樣品，用紫外分光光度計(jì)分別在280 nm和260 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以pH7.0磷酸緩沖液為空白調(diào)零。

按照以下公式計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度=1.45A280 nm-0.74A260 nm（mg/mL）；蛋白質(zhì)含量=（1.45A280 nm-0.74 A260 nm）n/樣品重×100%，式中，A280 nm為溶液在280 nm處的吸光度；A260 nm為溶液在260 nm處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)豆腐柴懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

外植體經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，在切口處形成白色或淺綠色愈傷組織。經(jīng)分散后進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞均能達(dá)到較好的增殖。但組織細(xì)胞顏色和形態(tài)各有差異，主要有4種類型（圖1），也有一些過(guò)渡類型。

染色后顯微鏡放大觀測(cè)，結(jié)果（圖2）表明，A類細(xì)胞多為橢圓形或接近圓形，形狀規(guī)則、體積較小、細(xì)胞核較大、內(nèi)含物豐富（圖2A）；B類細(xì)胞高度液泡化，有長(zhǎng)條形、半月形、圓形等一些不太規(guī)則的形狀。這類細(xì)胞體積大、內(nèi)含物少，細(xì)胞核較小，細(xì)胞染色淺，多數(shù)不著色（圖2B）；C類細(xì)胞形狀規(guī)則、體積較小、細(xì)胞間聯(lián)系緊密，壓片時(shí)不易分散（圖2C）；D類細(xì)胞基本為膨大變形呈長(zhǎng)條形細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞器的畸變細(xì)胞，形狀規(guī)則的細(xì)胞幾乎沒(méi)有（圖2D）。

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、KT、2，4-D和NAA，培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比組合、培養(yǎng)體系的顏色變化、鏡檢細(xì)胞形態(tài)變化見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)比較可以看出，添加2，4-D的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到的豆腐柴細(xì)胞內(nèi)含物較多，加NAA的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到得細(xì)胞多變形或死亡，分裂成碎片，另外，培養(yǎng)基中加6-BA的效果普遍要比KT好。

2.2 細(xì)胞分散程度對(duì)懸浮培養(yǎng)的影響

愈傷組織細(xì)胞分散方法對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系有一定影響。圖3是通過(guò)機(jī)械分散法處理愈傷組織后細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物狀況，培養(yǎng)體系中較渾濁（圖3A），細(xì)胞團(tuán)大小不均一，鏡檢會(huì)看到溶液中有較多死細(xì)胞，但容易產(chǎn)生較大的細(xì)胞團(tuán)，且細(xì)胞團(tuán)中易分化出胚性體細(xì)胞（圖3B）。利用纖維素果膠酶分散細(xì)胞后懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系，靜置后培養(yǎng)液較清澈，細(xì)胞團(tuán)大小較均一，培養(yǎng)后期亦會(huì)出現(xiàn)較大顆粒的胚性細(xì)胞。

2.3 光照條件對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)和生長(zhǎng)狀況的影響

將豆腐柴的葉接種于相同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別置于黑暗和12 h/d、2 000 lx光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種培養(yǎng)條件下的外植體產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間和誘導(dǎo)愈傷組織的出愈率基本相同，但愈傷組織的狀態(tài)有較大差異。光培養(yǎng)的愈傷組織呈翠綠色、質(zhì)地緊密，繼代后愈傷組織生長(zhǎng)緩慢；暗培養(yǎng)條件下愈傷組織呈白色，較易褐變，愈傷組織生長(zhǎng)疏松，繼代后生長(zhǎng)較快。因此，豆腐柴愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)宜在暗培養(yǎng)下進(jìn)行。

由于培養(yǎng)基中所加激素的不同，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液狀態(tài)和細(xì)胞鮮重增加量也不相同（表3）。結(jié)果顯示，愈傷組織分散程度越好，越有利于懸浮細(xì)胞系的建立，后期細(xì)胞增殖越明顯；懸浮培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基是MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT，其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞鮮重增加量平均每7 d可達(dá)6.46倍。

2.4 懸浮細(xì)胞果膠和蛋白質(zhì)含量

將外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后的豆腐柴愈傷組織細(xì)胞，經(jīng)纖維素酶和果膠酶處理后，置于經(jīng)上述最佳懸浮培養(yǎng)基MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT中，24 h黑暗條件，120 r/min懸浮振蕩培養(yǎng)21 d后，測(cè)定細(xì)胞果膠和蛋白質(zhì)含量。結(jié)果（表4）表明，培養(yǎng)細(xì)胞中果膠平均含量達(dá)6.57%，蛋白質(zhì)達(dá)到0.12%，遠(yuǎn)比豆腐柴天然葉片中含量低。

3 小結(jié)

結(jié)果表明，豆腐柴葉片誘導(dǎo)的疏松型愈傷組織細(xì)胞，經(jīng)過(guò)0.04 mg/mL纖維素酶+0.04 mg/mL果膠酶處理后可以得到較好的分散培養(yǎng)細(xì)胞，在最佳液體培養(yǎng)基MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT中， 24 h黑暗條件，120 r/min懸浮振蕩培養(yǎng)，大約7 d后即可得到較好的懸浮細(xì)胞系。雖然致密型愈傷組織塊，經(jīng)酶處理后也可以得到分散細(xì)胞，但由于后期培養(yǎng)系中細(xì)胞碎片較多，不利于懸浮細(xì)胞的增殖。初步測(cè)定比較了在最佳懸浮培養(yǎng)條件下，豆腐柴愈傷組織細(xì)胞和葉片中果膠和蛋白質(zhì)含量差異，結(jié)果顯示，豆腐柴懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中，主要的營(yíng)養(yǎng)成分果膠和蛋白質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葉片組織。后期需要對(duì)基本培養(yǎng)基配方、蔗糖濃度、前體物添加等因素進(jìn)一步優(yōu)化。

應(yīng)用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，促成細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分的合成，進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，可緩解當(dāng)前豆腐柴資源匱乏的困境；而且大量的研究也表明，相對(duì)于組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)更容易產(chǎn)生胚性細(xì)胞，進(jìn)而促成植株再生，這也為將來(lái)克服豆腐柴自然狀態(tài)下胚發(fā)育不足，種子難以繁殖等問(wèn)題奠定前期基礎(chǔ)[10，11]。雖然本研究中細(xì)胞增長(zhǎng)量及果膠等成分均較低，但后期通過(guò)對(duì)培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，可為豆腐柴細(xì)胞工廠化擴(kuò)大培養(yǎng)及有效成分提取提供理論依據(jù)。

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