劉春梅， 魏曉鋒， 高　誠

（1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 揚州 225009； 2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203）

液相芯片技術(shù)及其在蛋白質(zhì)和核酸檢測中的應(yīng)用

劉春梅1，2， 魏曉鋒2， 高誠2

（1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 揚州 225009； 2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203）

Luminex液相芯片技術(shù)是1990年代興起的，集合流式細胞技術(shù)、激光技術(shù)、微球數(shù)字信號處理技術(shù)為一體的新型檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)的臨床檢測方法相比，其主要優(yōu)點在于高通量、高敏感、重復(fù)性高、檢測范圍廣、反應(yīng)速度快，僅需微量樣品即可進行檢測等。Luminex具有兩大核心技術(shù)：xMAP?技術(shù)和xTAG?技術(shù)。xMAP?技術(shù)利用抗原-抗體反應(yīng)的原理，可用于蛋白質(zhì)和核酸的檢測；xTAG?技術(shù)能夠測定若干基因組形式，如基因表達分析、微RNA分析、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）分析、特定序列的檢測等。

Luminex； 液相芯片； 蛋白質(zhì)和核酸； 檢測

實驗動物病原體檢測是確保實驗動物質(zhì)量的有效措施之一， 隨著生命科學(xué)研究不斷深入，已經(jīng)形成多種檢測技術(shù)。選擇合適的檢測方法是保證實驗動物質(zhì)量評價的科學(xué)性和檢測結(jié)果準確性的基礎(chǔ)。實驗室檢查主要分為血清學(xué)診斷和病原學(xué)檢查［1］，目前國內(nèi)外實驗動物病毒檢測多采用血清學(xué)檢測方法。實驗室常用檢測技術(shù)包括核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、測序技術(shù)等等。當(dāng)步入后基因組時代，開始篩選大量已知的遺傳信息，相較于單一檢測系統(tǒng)，多重技術(shù)可以在一個反應(yīng)中同時檢測多個指標，大大減少時間和成本。因此實現(xiàn)快速、高通量、低成本的檢測就顯得尤為重要，Luminex液相芯片技術(shù)應(yīng)運而生。

1　病原體檢測新方法——Luminex液相芯片技術(shù)

液相芯片技術(shù)是1990年代中期發(fā)展起來的，它是集流式細胞技術(shù)、激光技術(shù)、微球數(shù)字信號處理技術(shù)為一體的新型的多重檢測技術(shù)。1997年，Clinical Chemistry雜志譽之為“真正的臨床應(yīng)用型生物芯片”，2001年，這項技術(shù)成為首個也是唯一得到美國FDA許可的用于臨床診斷的多指標檢測技術(shù)。Luminex公司提出并進行開發(fā)，于1999至2007年間先后推出了Luminex100、Luminex200 和Flexmap3D，逐步增強了檢測的準確性，提高了檢測效率。液相芯片技術(shù)為后基因組時代的科學(xué)研究提供了強大的技術(shù)支持，并且提供了高通量分子的分析平臺。

2　Luminex液相芯片技術(shù)的原理

Luminex液相芯片體系是由多種附著著不同探針的微球為主要基質(zhì)構(gòu)成的，將這些微球懸浮于一個液相環(huán)境中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。為了區(qū)分不同的探針，Luminex100、Luminex200 采用不同比例的2種熒光染料標記，可以標記100種微球；而Flexmap3D通過加入3種不同比例的熒光染料，可以標記500種微球。這些微球直徑在10 nm ～1 000 μm，而以5.6 μm最為常見。

根據(jù)使用對象不同， 微球主要分為5種: MicroPlex微球、SeroMap微球、LumAvidin微球、MagPlex微球和xTAG微球。微球原理基本相同，MicroPlex微球是最基本的， 其余4種是在此基礎(chǔ)上設(shè)計而成。其中SeroMap微球是專門為血清學(xué)檢測所設(shè)計的，它可以減少血清中不同抗體與微球的非特異結(jié)合；LumAvidin微球帶有抗生物素蛋白，從而更方便地結(jié)合微球上的目的蛋白；MagPlex微球和xTAG微球是帶有磁性的，xTAG微球連接了長度為24個堿基的anti-TAG序列的核酸探針，可用于核酸檢測。微球的選擇主要根據(jù)不同分析類型的需要，還要根據(jù)所使用儀器型號來選擇。

將微球懸浮于一個液相體系中，與待檢分子反應(yīng)充分后再加入報告分子藻紅蛋白，采用流式細胞術(shù)將微球體快速排成單列通過檢測通道，使用紅色和綠色兩束激光分別對單個微球進行照射。紅色激光激發(fā)微球本身的熒光物質(zhì)將微球分類，進行定性分析；綠色激光通過檢測微球上結(jié)合的熒光報告分子的數(shù)量，進行定量或半定量分析。為了滿足靶序列與微球的雜交所需要的嚴格雜交條件，確保高度特異性，使結(jié)果讀數(shù)具有強大的信號值和低的背景值，緩沖系統(tǒng)的選擇至關(guān)重要，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)使用含有四甲基氯化銨（Tetramethylammonium chloride， TMAC）的緩沖液能夠很好地滿足上述條件，該緩沖液被證明優(yōu)于其它緩沖系統(tǒng)［2，3］。

3　Luminex液相芯片技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法比較

Luminex液相芯片與傳統(tǒng)的臨床檢測方法比較，其主要優(yōu)點在于高通量、高敏感、重復(fù)性高、檢測范圍廣、反應(yīng)速度快，僅需微量樣品即可進行檢測等。液相芯片提供了一個均相的液體環(huán)境，在反應(yīng)中有利于生物大分子保持其正確的空間構(gòu)象，使反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定，在同一反應(yīng)體系中可以同時檢測多達500種指標。每個指標的檢測有至少2 500個微球，抽取其中的100個微球進行讀數(shù)，最終取所有值的中位數(shù)，從而大大減少試驗誤差。

Luminex液相芯片與聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)相比：液相芯片以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，其基本原理為核酸雜交法。為了進一步提高檢測效率，可以將液相芯片技術(shù)與多重PCR技術(shù)結(jié)合起來，使得在一個反應(yīng)管中可以同時進行多種樣本的核酸檢測。Wessele等［4］利用xTAG多重胃腸道病原體檢測試劑盒測試了393個糞便樣本，在76個樣本中共檢測出83個目標病原體，此試劑盒是基于Luminex的 xTAG 技術(shù)和多重PCR技術(shù)相結(jié)合的原理設(shè)計而成的， 可在一個樣本中同時檢測15種引起腹瀉的細菌、病毒及寄生蟲。Luminex液相芯片對引物和探針的設(shè)計有一些特殊要求: 探針的長度最好在18～20 bp。為了減少微球雜交反應(yīng)時的位阻效應(yīng)， 更有利于雜交反應(yīng)的進行，應(yīng)將擴增長度控制在100～300 bp左右，而且要盡量避免上、下游引物之間發(fā)卡結(jié)構(gòu)以及引物二聚體的產(chǎn)生。

Luminex液相芯片與酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）相比：Charles River Laboratories（CRL）利用大量已知陰性和陽性的鼠血清，在感染的不同階段，分別利用兩種方法對相同的樣本進行了差異對比試驗，趙化陽等［5］對CRL實驗結(jié)果進行了總結(jié)。結(jié)果顯示，小鼠血清抗體吻合度達99%，而大鼠血清抗體吻合度達94%。在靈敏度方面，將已知鼠抗病毒血清倍比稀釋用于檢測，兩種方法的靈敏度相當(dāng)。在敏感性方面，Luminex液相芯片方法對感染早期出現(xiàn)的抗體較為敏感，ELISA敏感的抗體則出現(xiàn)在感染的相對后期。

Luminex液相芯片與固相芯片相比，主要具有以下優(yōu)點：（1）Luminex液相芯片靈活性好，可根據(jù)需要調(diào)整檢測體系，過程簡便；（2）微球直徑小，容易混懸在液體中，且液體環(huán)境有利于分子間的相互作用，從而提高檢測速度；（3）克服了固相芯片在大分子檢測時受空間效應(yīng)、表面張力等對反應(yīng)的干擾，檢測結(jié)果的準確性和可重復(fù)性大大提高［6］。 Luminex液相芯片除具有一般的固相基因芯片的功能，如核苷酸測序、單核苷酸多態(tài)性分析、基因作圖等，還體現(xiàn)了同時定性、定量分析特征［7］。

Luminex液相芯片與測序技術(shù)相比: Fukushima等［8］利用Luminex液相芯片技術(shù)對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌KRAS基因突變狀態(tài)進行研究， 能夠在PCR板的一個加樣孔中對多個突變同時分析， 且分析結(jié)果相當(dāng)于直接測序方法。齊淑貞等［9］分別采用測序法及液相芯片雜交法對生殖道人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus， HPV）感染進行分型，對兩種技術(shù)進行了比較。結(jié)果表明：測序法可以通過HPV相對保守的晚期基因L1片段約450個堿基對的比較來區(qū)分不同型別，而Luminex雜交可用20個左右的堿基對來區(qū)分。在單一型感染中測序法較準確，可以排除雜交產(chǎn)生的假陽性；而當(dāng)多重型的HPV擴增效率不一樣或者其中一種型別的量比其他型別高很多時，結(jié)果可能出現(xiàn)其中一種型別的產(chǎn)物占絕對優(yōu)勢，此時測序法就無法分辨，造成假陰性，將混合型判斷成單一型。且在測序過程中可能產(chǎn)生雜峰圖形，需要通過人為判斷來確定，所以在多重型感染的分型方面Luminex法更有優(yōu)勢。

Luminex液相芯片與熒光定量PCR相比：Foord等［10］以馬為實驗對象，通過液相芯片方法和熒光定量PCR的方法對亨德拉病毒（Hendra virus，HeV）和尼帕病毒（Nipah virus， NiV）感染進行檢測，得出如下結(jié)論：在敏感性方面，通過10倍連續(xù)稀釋HeV的模板RNA檢測，兩種方法的檢測敏感性相當(dāng)；在準確性方面，Luminex液相芯片更占優(yōu)勢，液相芯片有明顯的區(qū)分陰性結(jié)果和陽性結(jié)果的標準，誤判率低，如3號馬在感染后2 d、4 d和5 d時能夠通過液相芯片的方法檢測出HeV陽性，而熒光定量PCR的判定結(jié)果為陰性或不確定。

4　Luminex液相芯片技術(shù)的應(yīng)用

Luminex具有兩大核心技術(shù): xMAP?技術(shù)和xTAG?技術(shù)。xMAP?技術(shù)把針對不同待測物的抗體分子或者基因探針以共價結(jié)合的方式偶聯(lián)到特定的編碼微球上，每個編碼微球都有對應(yīng)的檢測項目，可用于蛋白質(zhì)和核酸的檢測。xTAG?技術(shù)則使用Luminex專有的TAG標簽序列，通過TAG序列與anti-TAG序列的專一性互補配對實現(xiàn)樣本序列同微球的雜交而不需要單獨設(shè)計探針。xTAG?技術(shù)能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標記的微球之間交叉雜交。因此，xTAG?技術(shù)具有xMAP?技術(shù)的優(yōu)勢，但應(yīng)用相對局限，主要應(yīng)用在多重型病原體核酸檢測方面。

4.1xMAP?技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用

xMAP?技術(shù)在蛋白水平的檢測，是將蛋白作為探針偶聯(lián)到微球上，其原理是抗原-抗體反應(yīng)。xMAP?技術(shù)可以利用100種不同的聚苯乙烯微球，而每種微球的表面可以偶聯(lián)某一特定抗原，與標記抗體進行孵育并洗滌后進行檢測，實現(xiàn)在同一反應(yīng)孔內(nèi)同時檢測上百種抗原抗體。因此CRL又將此方法稱為多通路免疫熒光檢測方法（Multiplexed Fluorometric Immuno Assay， MFIA），該方法具有高通量、快速、靈活的特點。CRL利用MFIA進行了實驗動物質(zhì)量控制方面的研究，已經(jīng)推出了應(yīng)用于大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、兔等實驗動物血清學(xué)檢測相關(guān)試劑。

xMAP?技術(shù)檢測蛋白的方法有雙抗體夾心法，競爭法和間接法。雙抗體夾心法用于檢測抗原， 如激素、酶、藥物、疾病標志物等， 其原理與ELISA的雙抗體夾心法相同，是將針對這些抗原蛋白的抗體偶聯(lián)到微球上作為探針進行檢測。Bjerre等［11］利用多重分析方法同時檢測豬的細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10及熱休克蛋白32，沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。Hornum等［12］為證明甘露糖結(jié)合凝集素（mannose binding lectin， MBL）參與心血管病理生理學(xué)以及MBL的保護效果，對98例等待腎臟移植的終末期腎病患者進行口服葡萄糖耐量試驗，利用Luminex的xMAP?技術(shù)對MBL血清學(xué)水平進行測定。競爭法只適用于一些小分子，單一表位或者單一抗體，它的優(yōu)點是可以對不純的樣本進行檢測。間接法適用于血清中抗體的測定，是將蛋白質(zhì)抗原偶聯(lián)到微球上作為探針進行檢測。Biagini等［13］同時檢測23種肺炎球菌莢膜多糖血清型，測量抗肺炎球菌多糖特異性抗體水平。與常規(guī)檢測方法ELISA相比，速度更快，適用的樣本體積更少， 靈敏度更高。Shichijo等［14］通過檢測嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）的合成肽，對免疫力進行評估。從3個感染者的血清中提取出197個不同的SARS冠狀病毒的蛋白質(zhì)，并從中篩選IgG的抗體反應(yīng)。其中S791，M207和N161在感染后的血清中可以檢出，通過對這3種肽的研究，可以更好地理解SARS冠狀病毒的免疫原性。

xMAP?技術(shù)還可用于細胞因子的檢測: Balasa［15］等通過Luminex液相芯片方法監(jiān)測白介素-2和腫瘤壞死因子-α的表達水平來確定自然殺傷細胞和骨髓瘤細胞的活性，以此研究治療多發(fā)性骨髓瘤藥物elotuzumab的作用途徑。李煒曄等［16］在探討胸腺肽α-1對正常小鼠機體相關(guān)免疫效應(yīng)分子的作用及胸腺肽α-1誘導(dǎo)特異性免疫耐受的機制時，也采用Luminex液相芯片方法檢測IL-1α，IL-2，IL-6，IL-17等細胞因子。

4.2xTAG?技術(shù)在核酸檢測中的應(yīng)用

xTAG?技術(shù)使用TAG標簽序列， TAG與anti-TAG是根據(jù)結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）的序列設(shè)計而成，不含有堿基G，且TAG與anti-TAG反向互補、雜交溫度一致［17］。xTAG?技術(shù)能夠進行許多基因組形式測定，如基因表達分析、微RNA分析、單核苷酸多態(tài)性分析、特定序列的檢測等其他應(yīng)用。

寡核苷酸連接分析（Oligo Ligation Assay， OLA）:該方法簡單靈活，價格低廉?？捎糜趩魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）分型［18］或其他序列變異的檢測。在OLA反應(yīng)體系中包括一個或多個帶有TAG序列的OLA-TAG探針以及有生物素標記的OLA報告探針。在目標SNP位點，只有當(dāng)OLA-TAG探針的3'端和OLA報告探針的5'端堿基互補，才能在連接酶的作用下連接，通過若干循環(huán)的連接反應(yīng)使信號放大。而一旦產(chǎn)生變異，堿基的變化導(dǎo)致堿基配對不能完成，則不能發(fā)生連接，從而不能產(chǎn)生顯著的化學(xué)信號。利用此方法，Henry-Halldin等［9］進行按蚊品種鑒定； Schwartz等［20］進行囊性纖維化變異的鑒定。

等位基因特異性引物延伸（Allele-Specific Primer Extension， ASPE）: 可用于不同基因和生物的分型。在ASPE反應(yīng)中，每個ASPE探針的5'末端連接獨特TAG標簽序列用以識別不同SNP變異。在反應(yīng)體系中某dNTP帶有生物素標記，因此產(chǎn)物帶有標記。當(dāng)探針3'端的堿基互補于靶SNP的堿基，則可以作為引物在DNA聚合酶的作用下繼續(xù)合成含有生物素標記的新的DNA，隨著幾輪引物延伸，可以產(chǎn)生大量的標記分子，在一個反應(yīng)分析中可以生成多種基因型信號。反之，3'端的堿基不匹配，則不能進一步延伸。在進行ASPE反應(yīng)之前，基因組DNA在每個SNP區(qū)域利用多重PCR進行擴增，擴增的產(chǎn)物可以是不同長度的，甚至可以包含多個單核苷酸多態(tài)性。利用此方法，Koo等［21］進行ABC轉(zhuǎn)運蛋白多態(tài)性和基因分型研究；Li等［22］利用Luminex液相芯片能同時檢測70個等位基因，實現(xiàn)了高通量的檢測方法； 陳剛等［23］利用ASPE方法對47例轉(zhuǎn)移性肺癌患者的樣本進行表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）外顯子19 和21基因突變檢測，檢測結(jié)果與RT-PCR法完全一致。朱鵬等［24］利用Luminex液相芯片技術(shù)能夠快速、高通量地檢測出各SNP位點的MFI值，從而在8 h內(nèi)一次性成功確定東方型鼠疫菌中18個SNP的堿基狀態(tài)，得出36株東方型鼠疫菌的基于18個SNP可以分為7個基因型的結(jié)論。

目標特異性引物延伸（target-specific primer extension， TSPE）: 在與微球雜交前， 傳統(tǒng)的方法是用帶有TAG序列的探針對擴增產(chǎn)物進行延伸， 以得到帶有單鏈TAG序列的片段，并用生物素標記［25］。此方法有不足之處: 在PCR反應(yīng)中，雙鏈PCR產(chǎn)物沿著目標序列進行延伸，由于TAG序列將優(yōu)先與其互補的序列結(jié)合，而不直接與微球的anti-TAG序列連接，因此產(chǎn)生的信號強度較低。TSPE可以解決上述問題，通過含有TAG序列的上游引物來實現(xiàn)：上游引物的5'端連接TAG，中間用12～18個原子（spacer）作間隔。下游引物的5'端用生物素標記。通過PCR反應(yīng)，合成的產(chǎn)物中包含TAG序列的單鏈突出端和生物素標記的雙鏈序列。TAG序列的突出端可以和微球上的anti-TAG序列結(jié)合。為了達到最佳反應(yīng)效果，PCR產(chǎn)物目的片段的大小最好在100～150 bp。Foord等［10］通過此方法，在HeV感染馬2 d后就可以將其檢測出來，檢測敏感性高，且能檢測出熒光定量PCR不能確定或者定為陰性的結(jié)果。Mahony等［26］通過液相芯片與多重PCR連用，準確檢測亞型季節(jié)性和大流行性流感病毒， 并且準確地檢測出H275Y奧司他韋抗性等位基因。

小分子RNA的檢測：PCR檢測方法和直接雜交法可用于小分子RNA表達水平的分析，但基于PCR的方法只能進行單個反應(yīng)，時間長，需要樣品多［27，28］； 而雜交測定法需要使用特殊的探針和分析工具，價格昂貴［29］，且缺乏對單個堿基的分辨率。與上述方法相比，Luminex液相芯片技術(shù)具有三大優(yōu)勢：第一，磁珠連接有獨特的標簽序列，這些序列不與生物群落任何已知的序列雜交；第二，生物素標記的嵌合探針中的DNA序列100%互補于成熟miRNA的目標序列，且TAG序列100%互補于微球上的anti-TAG序列；第三，可以實現(xiàn)對單個堿基的分辨率。由于miRNA表達譜能夠反映腫瘤的組織來源和分化狀態(tài)，Kaucsar等［30］采用Luminex多重檢測的方法對急性腎損傷病人的腎臟中miR-21、 miR-17-5p和miR-106a等的表達水平進行檢測。He等［31］利用液相芯片技術(shù)研究放療對胃癌早期和中期的效果，與未輻照的樣本相比，暴露X射線的樣本中16miRNA表達量下調(diào)，而2miRNA的表達量顯著上調(diào)。

5　小結(jié)與展望

在實驗動物血清學(xué)檢測方面，尤其是小鼠、倉鼠等體型較小的實驗動物，可用血清數(shù)量少，不能滿足常規(guī)檢測方法對多種病原微生物的檢測所需血清的量。而Luminex液相芯片僅需要少量的樣本即可同時對多種病原微生物進行快速、準確的檢測。Luminex液相芯片技術(shù)高通量、高精確性的特點符合臨床所需的多指標聯(lián)合檢測的思路，在臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤標志物的檢測、遺傳性疾病的基因診斷、感染性疾病病原體鑒別以及自身免疫性疾病的早期診斷等方面。當(dāng)然其技術(shù)尚有一些問題需要進一步解決，比如：Luminex液相芯片不能連續(xù)監(jiān)測待測樣品的濃度；不能監(jiān)測樣品靶序列與微球上探針的結(jié)合情況；由于Luminex系統(tǒng)是一個開放平臺，PCR產(chǎn)物還存在污染實驗室的可能［6］。

Luminex液相芯片在蛋白質(zhì)檢測方面， CRL進行了深入研究， 研制出多通路免疫熒光檢測方法MFIA的相關(guān)產(chǎn)品，用于大鼠、小鼠、豚鼠、兔等實驗動物質(zhì)量控制，對感染早期敏感性較高，能夠更早地發(fā)現(xiàn)并控制疾?。?］； 而在核酸檢測方面液相芯片技術(shù)的研究還不夠深入， 但隨著流體技術(shù)、激光技術(shù)和數(shù)字信號處理技術(shù)研究的不斷深入，液相芯片技術(shù)將會在更多領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用，也會對實驗動物病原體檢測技術(shù)的發(fā)展起更大推動作用。

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Liquichip Technology and Its Application in Detection of Protein and Nucleic Acid

LIU Chun-mei1，2， WEI Xiao-feng2， GAO Cheng2
（1. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai201203， China）

Liquichip is a new type of detection technology developed in the 1990s， which is integrated with flow cytometry， laser technology and digital signal processing. Compared with the traditional clinical detection methods， the main advantages are the high-throughput， high-sensitivity， high reproducibility，wide detection range， fast response， and only small amount of testing sample wanted. Luminex has two core technologies: xMAP?technology and xTAG?Technology. xMAP?technology utilizing an antigenantibody reaction principle， can be used for the detection of proteins and nucleic acids. xTAG?technology can be used for a number of genomic assay formats such as gene expression analysis， microRNA analysis， single nucleotide polymorphism （SNP）analysis， specific sequence detection and other applications.

Luminex； Liquichip； Proteins and nucleic acids； Detection

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0076-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.016

2014-8-26

上海市科技創(chuàng)新行動計劃（13140900700）

劉春梅（1990-）， 女， 碩士研究生。研究方向: 實驗動物質(zhì)量檢測技術(shù)。E-mail: luhuan29@126.com

魏曉鋒， 男， 副研究員。E-mail: wei.xf@outlook.com