唐艷萍，張力圖，蔡政民，唐亞梅，蘇程琳，譚曉玉，謝雨萱，利基林(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

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102例急性白血病的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)分型

唐艷萍，張力圖，蔡政民，唐亞梅，蘇程琳，譚曉玉，謝雨萱，利基林(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

摘要：目的觀察102例急性白血病的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)分型結(jié)果。方法采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型、流式細(xì)胞學(xué)免疫分型、多重巢式RT-PCR檢測白血病融合基因三項(xiàng)技術(shù)對102例急性白血病患者進(jìn)行綜合診斷分析。結(jié)果102例白血病患者按FAB分型診斷為ALL 51例，AML 45例，難分類白血病(UAL)6例。FAB分型無法確診的6例UAL患者經(jīng)流式免疫分型后診斷為2例B-ALL、3例B /T細(xì)胞系白血病和1例急性混合型白血病(髓系/B細(xì)胞系)，其余96例患者與流式分型結(jié)果一致，診斷為B-ALL 36例，T-ALL 15例，AML 45例。102例急性白血病患者中檢出融合基因36例(35.3%)，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL 9種融合基因。結(jié)論FAB分型對UAL無法確診時(shí)，與細(xì)胞免疫學(xué)及分子生物學(xué)分型聯(lián)合，可使白血病分型更為精確、客觀。

關(guān)鍵詞：急性白血病；形態(tài)學(xué)分型；免疫學(xué)分型；融合基因

傳統(tǒng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是診斷白血病的基礎(chǔ)，診斷標(biāo)準(zhǔn)簡便，然而光鏡下形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞化學(xué)方法對細(xì)胞識別力有限，對于未分化型白血病及一些形態(tài)學(xué)不典型的白血病，難以準(zhǔn)確分型，其診斷有一定的局限性[1]。目前，WHO要求白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷、臨床癥狀、體征的聯(lián)合診斷法。本研究以102例急性白血病患者為對象，以形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子學(xué)生物學(xué)特征相結(jié)合的方式，采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型、流式細(xì)胞學(xué)免疫分型、多重巢式檢測RT-PCR白血病融合基因三項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行綜合判斷，以使白血病的診斷分型更加科學(xué)化和規(guī)范化。

1資料與方法

1.1臨床資料廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2011年8月～2013年12月收診的102例急性白血病初治患者。男72例、女30例，年齡2～80歲?；颊呔?jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查確診，符合WHO的FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)。ALL 51例，AML 45例，難分類白血病(UAL)6例。

1.2主要儀器及試劑Beckman-Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter公司)；TProfessional熱循環(huán)儀(biometra公司)；UVI FireReader 凝膠成像系統(tǒng)(UVITEC公司)；MK-20干式恒溫儀(杭州奧盛)。單克隆抗體：異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD20、sIgM、cIgM、CD5、CD7、TdT、HLA-DR、CD13、 MPO；藻紅蛋白熒光素 (PE)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD2、CD10、CD22、CD33、CD117、cCD79a；藻紅蛋白—得克薩斯紅(ECD)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD3、CD14、CD19、CD34、cCD3；藻紅蛋白—花青素(PE-Cy5)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD45；溶血?jiǎng)?、破膜劑、固定劑、鞘?PBS)均購自Beckman-Coulter公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理嚴(yán)格按無菌操作規(guī)程，取患者骨髓，每管2～3 mL，EDTA抗凝，混勻，分別行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞學(xué)免疫分型及融合基因檢測。

1.3.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查患者骨髓涂片，行免疫組化染色分析白血病的分型(FAB分型)。

1.3.3流式細(xì)胞學(xué)免疫分型采用四色熒光素(FITC、PE、PC5、ECD)標(biāo)記法進(jìn)行骨髓血細(xì)胞免疫表型分析。細(xì)胞膜抗體標(biāo)記：取15 μL樣品與單抗5 μL混勻后室溫避光孵育15 min，加入600 μL溶血?jiǎng)┗靹虮芄夥跤?5 min，鞘液洗滌2次，100 μL鞘液重懸即可上機(jī)檢測。胞質(zhì)內(nèi)抗體標(biāo)記：取15 μL樣品與5 μL CD45混勻后室溫避光孵育15 min，加固定劑避光孵育15 min后鞘液洗滌，加40 μL破膜劑避光孵育15 min，加入待測抗體各5 μL，鞘液洗滌2次，100 μL鞘液重懸即可上機(jī)檢測。結(jié)果判定以膜抗原≥20%，胞質(zhì)內(nèi)抗原≥10%為陽性。

1.3.4多重巢式RT-PCR檢測 ①細(xì)胞總RNA提取：分離患者骨髓的單個(gè)核細(xì)胞，采用血液總RNA提取試劑盒(天根，貨號：DP433)提取總RNA，并通過微量紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL， 含Oligo dT18 Primer、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP、RNasin、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶。42 ℃、1 h, 70 ℃、5 min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。③PCR擴(kuò)增：采用融合基因篩查試劑盒(北京思爾成公司，貨號：F103)進(jìn)行多重巢式PCR。第1輪擴(kuò)增條件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，59 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃、8 min。第2輪擴(kuò)增條件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，59 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃、8 min。④PCR 產(chǎn)物電泳：取第2輪PCR產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

2結(jié)果

2.1FAB分型102例白血病患者按FAB分型診斷為ALL 51例，其中L17例，L237例，L37例；AML 45例，其中M11例，M214例，M310例，M46例，M514例；UAL 6例。

2.2白血病流式細(xì)胞學(xué)免疫分型102例白血病中根據(jù)免疫分型診斷為B-ALL共38例，T-ALL共15例，AML共45例。6例FAB無法確診的UAL經(jīng)流式免疫分型后診斷為ALL(B /T細(xì)胞系)3例，其中急性混合型白血病(髓系/B細(xì)胞系)1例，B-ALL 2例；其余96例患者與流式分型結(jié)果一致，診斷為B-ALL 36例，T-ALL 15例，AML 45例。38例B-ALL主要表達(dá)抗原依次為cCD79a(89.5%，34/38)、CD19(86.8%，33/38)、CD10(78.9%，30/38)、CD22(76.3%，29/38)，非特異性早期標(biāo)志抗原HLA-DR(73.7%，28/38)表達(dá)率較高。B-ALL交叉表達(dá) CD33有10例(26.3%，10/38)，CD2有2例(5.3%，2/38)，CD5有2例(5.3%，2/38)。15例T-ALL患者最敏感的指標(biāo)為cCD3(80.0%，12/15)、CD7(80.0%，12/15)，其次為CD2(73.3%，11/15)、CD5(66.7%，10/15)。T-ALL有4例 CD10(26.7%，4/15)、2例CD33(13.3%，2/15)交叉表達(dá)。45例AML患者中，以CD33、cMPO、CD117表達(dá)高，分別為97.8%(44/45)、84.4%(38/45)、73.3%(33/45)。AML中交叉表達(dá) CD7有3例(6.7%，3/45 )、CD19有3例(6.7%，3/45)。

2.3多重巢式RT-PCR檢測白血病相關(guān)融合基因102例急性白血病患者檢出融合基因36例，總檢出率為35.3%。在56例急性淋巴細(xì)胞白血病患者中檢出融合基因21例，總檢出率為37.5%，包括TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL6種融合基因，分別為3、6、4、2、1、5例，各占14.3%、28.6%、19.0%、9.5%、4.8%、23.8%。 8例ALL-L3未檢出融合基因。在45例急性髓細(xì)胞白血病患者中, 檢出融合基因14例，總檢出率為31.1%，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、MLL/AF9 4種融合基因，分別為7、4、1、2例，各占50.0%、28.6%、7.1%、14.3%。此外，1例急性混合型白血病檢出TLS/ERG融合基因。

3討論

白血病是造血組織的原發(fā)惡性疾病，具有生物學(xué)的異質(zhì)性、分化程度的差異性和細(xì)胞形態(tài)的多形性等特點(diǎn)，其診斷需進(jìn)行明確分型[2]。伴隨科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，白血病的分型得到不斷完善，從最初的FAB分型，到最新的MICM分型。本研究對102例急性白血病進(jìn)行FAB分型、免疫分型及分子生物學(xué)特性的聯(lián)合分析。按FAB分型診斷ALL 51例，AML 45例，UAL 6例。傳統(tǒng)FAB分型診斷的ALL和AML與免疫分型基本一致，6例UAL根據(jù)流式免疫分型可以明確診斷為2例B-ALL、3例ALL(B /T細(xì)胞系)、1例急性混合型白血病(髓系/B細(xì)胞系)。因此，根據(jù)免疫分型診斷ALL 56例，其中B-ALL共38例，T-ALL 15例，B /T細(xì)胞系3例；AML45例；髓系/B細(xì)胞系1例。

CD13、CD33具有骨髓相對特異性；MPO為中性粒細(xì)胞內(nèi)嗜苯胺藍(lán)顆粒的主要成分，其蛋白于早幼粒階段開始合成，MPO是髓系特異性標(biāo)志[3]。有研究[4]表明CD117是髓系較特異的表面標(biāo)志，可作為輔助診斷AML的標(biāo)志抗原。本研究發(fā)現(xiàn)，AML患者M(jìn)1～M5各亞型廣泛表達(dá)CD33(97.8%)、CD117(73.3%)和胞質(zhì)內(nèi)抗原cMPO(84.4% )，但特異性有所差異。CD33在B-ALL、T-ALL中有交叉表達(dá)，表達(dá)率為26.3%、13.3% 。而 CD117(5.3%、6.7%)和 cMPO(5.3%，0% )交叉表達(dá)少見，特異性較好。在較多文獻(xiàn)[5，6]中還報(bào)道了AML患者高表達(dá)CD13，但在本次研究中CD13的表達(dá)率僅為31.1%，并且6例M4無1例表達(dá)。

B淋巴系最常見的抗原有cCD79、CD19、CD10、CD20、CD22。cCD79a是B淋巴系的特異性標(biāo)志，只表達(dá)與胞質(zhì)內(nèi)，不表達(dá)于細(xì)胞膜。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道CD10對預(yù)后判斷具有提示作用，通常CD10陽性B-ALL患者預(yù)后較好。本研究中cCD79a在B-ALL中高表達(dá)(89.5%)，在AML中偶有表達(dá)(4.4%)，在T-ALL中無表達(dá)。CD19(86.8%、CD10(78.9%)、CD22(76.3%)在 B-ALL中常見表達(dá)，CD20敏感性較差，表達(dá)率只有36.8%。cCD3抗原是T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)志，其在胞質(zhì)內(nèi)的出現(xiàn)早于細(xì)胞膜，因此檢測胞質(zhì)內(nèi)敏感性強(qiáng)于胞膜。T-ALL中cCD3(80.0%)、CD7(80%)、CD2(73.3%)和CD5(66.7%)的敏感性及特異性均較高，在AML和B-ALL中表達(dá)極低。

多數(shù)白血病遺傳學(xué)異常與形態(tài)學(xué)的關(guān)系尚無明確關(guān)系，但已發(fā)現(xiàn)某些融合基因在FAB分型中具有特定的分布特點(diǎn)[8]。PML/RARα融合基因由t(15;17)(q22；q21)染色體異位形成，主要見于AML-M3。本研究所檢出的7例均出現(xiàn)于M3患者。CBFβ/MYH11融合基因由inv(16)(p13；q22)及t(16；16)(p13；q22)染色體異位形成，主要見于M4，也見于部分M5，少數(shù)見于M2。檢出的4例CBFβ/MYH11融合基因出現(xiàn)于3例M4和1例M2患者。TEL/AML1融合基因是兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中最常見的染色體結(jié)構(gòu)異常，常見于25%的兒童B-ALL患者，患者對治療反應(yīng)佳，完全緩解時(shí)間長，預(yù)后好。本研究檢出的6例陽性表達(dá)患者均為兒童，年齡4～15歲，免疫分型顯示均為B-ALL。E2A/PBX融合基因主要見于3%～5%兒童和3%的成人ALL患者，約占兒童前驅(qū)B細(xì)胞ALL患者的25%。本研究檢測出的4例陽性表達(dá)患者均為兒童前驅(qū)B細(xì)胞ALL患者。檢出的5例BCR/ABL陽性患者經(jīng)免疫分型分析為B-ALL患者，與報(bào)道[9]相一致。此外，TLS-ERG與MLL/AF9兩種融合基因在ALL和AML患者中均出現(xiàn)。

本研究以FAB分型為基礎(chǔ)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的免疫分型，采用單克隆抗體對白血病的細(xì)胞來源和分化階段進(jìn)行更精細(xì)的檢測，從而提高了白血病診斷的準(zhǔn)確率，彌補(bǔ)了FAB分型的不足。再聯(lián)合分子生物學(xué)檢測，以其靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，使白血病分型更為精確、客觀，為臨床診斷、預(yù)后及治療方案的選擇提供更為可靠的依據(jù)。

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(收稿日期：2014-08-29)

通信作者：利基林

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(1298003-2-8)。

中圖分類號：R733.71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)03-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.014