大腸癌干細(xì)胞標(biāo)記物及其相關(guān)信號(hào)通路的研究進(jìn)展

梅命珠，隋華，張怡，程悅蕾，柴妮，朱惠蓉

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

摘要：存在于大腸癌組織中的大腸癌干細(xì)胞，雖只占極少部分，但其對(duì)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用。目前，關(guān)于大腸癌干細(xì)胞的研究主要集中于大腸癌干細(xì)胞的篩選和鑒定方面及大腸癌干細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制等，關(guān)于大腸癌干細(xì)胞的標(biāo)記物有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶聯(lián)受體5與乙醛脫氫酶1，大腸癌干細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路包括Wnt、Hedgehog和Notch通路。這些信號(hào)通路在維持大腸癌干細(xì)胞生長及增殖中具有重要作用。

關(guān)鍵詞：大腸腫瘤；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞表面標(biāo)記物；信號(hào)通路

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.040

中圖分類號(hào)：R735.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃(重大研究)項(xiàng)目(ZYSNXD-CC-ZDYJ048)。

收稿日期：(2015-06-01)

收稿日期：(2015-08-10)

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中少量具有無限增殖和不定向分化潛能細(xì)胞群體，是形成不同分化程度腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞可不斷增殖及發(fā)生轉(zhuǎn)移的根源。與正常干細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞的增殖分化無序甚至失控，不能像正常干細(xì)胞那樣有序高效地分化成為成熟細(xì)胞，反而易出現(xiàn)各種錯(cuò)誤，致使組織發(fā)生惡變。因此腫瘤干細(xì)胞的存在可能是腫瘤惡變的原因。起初，腫瘤干細(xì)胞最早被發(fā)現(xiàn)存在于血液系統(tǒng)的惡性腫瘤中。隨后，研究人員從乳腺癌實(shí)體腫瘤中分離出了腫瘤干細(xì)胞，首次證實(shí)了實(shí)體腫瘤中腫瘤干細(xì)胞的存在。此后，研究者先后從肺、消化道、前列腺、乳腺、結(jié)直腸等腫瘤的實(shí)體腫瘤中成功分離篩選出腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞的分離主要采用流式細(xì)胞法和免疫磁珠分選法，根據(jù)細(xì)胞表達(dá)不同表面標(biāo)記的特征進(jìn)行細(xì)胞群篩選，比較各組細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為差異，從而篩選出優(yōu)勢細(xì)胞的表面標(biāo)記。目前大腸癌干細(xì)胞表面的特異性生物標(biāo)記有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶聯(lián)受體5 ( Lgr5) 與乙醛脫氫酶1(ALDH1)等。而諸多研究表明在大腸癌干細(xì)胞中存在著許多復(fù)雜的分子信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin、TGF-β、Hedgehog以及Notch等信號(hào)通路在維持大腸癌干細(xì)胞的生長及增殖中具有重要作用，并且目前對(duì)其研究較為透徹?，F(xiàn)對(duì)大腸癌干細(xì)胞標(biāo)記物及其相關(guān)信號(hào)通路的研究進(jìn)展情況綜述如下。

通信作者：朱惠蓉

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1大腸癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記物

1.1CD44CD44是一種位于細(xì)胞膜上的多功能I類跨膜糖蛋白。作為細(xì)胞黏附分子主要參與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。Schulenburg等[1]在大腸癌組織中分離的CD44陽性和CD44陰性細(xì)胞的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，CD44陽性細(xì)胞無論是體內(nèi)致瘤性，還是體外克隆形成能力，均明顯高于CD44陰性細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，CD44陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征，其表現(xiàn)出的增殖、侵襲能力明顯強(qiáng)于CD44陰性細(xì)胞[2，3]。因此，CD44已被公認(rèn)為是大腸癌干細(xì)胞的標(biāo)記物之一。

1.2CD133CD133最初被認(rèn)為是造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)記物。其是一種5-跨膜糖蛋白，含有865個(gè)氨基酸。CD133最早被證明為結(jié)腸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記，是通過小鼠腎被膜移植模型。研究發(fā)現(xiàn)CD133陰性細(xì)胞不能形成腫瘤，而CD133陽性的結(jié)腸癌干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力，以及傳代致瘤的特征，故從功能學(xué)的角度證明CD133作為結(jié)腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)記的合理性[4]。但隨后Shmelkov等[5]發(fā)現(xiàn)，CD133陽性和CD133陰性的腫瘤細(xì)胞移植到NOD/SCID的小鼠體內(nèi)，則兩種細(xì)胞均能很快地生成腫瘤。而且，CD133陰性的腫瘤細(xì)胞更具有侵略性，形成腫瘤的速度更快，說明轉(zhuǎn)移的大腸癌細(xì)胞不論是否表達(dá)CD133，均具有引發(fā)腫瘤生成的能力。因此，CD133是否能作為大腸癌干細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記還有待于進(jìn)一步研究。

1.3ALDH1 ALDH1是一種能催化細(xì)胞內(nèi)的乙醛氧化為乙酸的解毒酶。已有研究證實(shí)，正常大腸組織干細(xì)胞存在于隱窩底部，主要表達(dá)ALDH1、CD133和CD44。故ALDH1被認(rèn)為可用于鑒定正常腸道干細(xì)胞。而其與大腸癌腫瘤干細(xì)胞關(guān)系的研究，是在腫瘤組織和正常大腸組織的對(duì)比下進(jìn)行。Huang等[6]在大腸癌組織中發(fā)現(xiàn)ALDH1高表達(dá)，并成功利用ALDH1的表達(dá)差異在動(dòng)物模型內(nèi)篩選出了大腸癌干細(xì)胞。此外，Dylla等[7]利用有限稀釋法所獲得的具有腫瘤干細(xì)胞特性的大腸癌細(xì)胞系，證明了ALDH1與大腸癌干細(xì)胞的相關(guān)性，并指出ALDH1的氧化作用是細(xì)胞對(duì)環(huán)磷酰胺發(fā)生耐藥的重要機(jī)制。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中ALDH1的染色程度與腫瘤細(xì)胞的分化程度間存在明顯的正相關(guān)性，且ALDH1陽性患者較ALDH1陰性患者生存期更短[8]。以上結(jié)果提示，ALDH1可作為一個(gè)標(biāo)記大腸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記物，并可作為判斷大腸癌患者疾病發(fā)展及其預(yù)后的重要指標(biāo)。

1.4 Lgr5Lgr5是G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，是由具有18個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個(gè)跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白，在人體內(nèi)分布廣泛[9，10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[11]，結(jié)腸原發(fā)腫瘤組織中Lgr5 mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組上調(diào)了64%；在已建立的Lgr5轉(zhuǎn)基因裸鼠模型中，發(fā)現(xiàn)裸鼠于30周后成功長出結(jié)腸腺瘤，致瘤率達(dá)100%，提示Lgr5異常表達(dá)可誘導(dǎo)正常干細(xì)胞的腫瘤性增殖。此外，Kemper等[12]將Lgr5作為大腸癌干細(xì)胞的分選標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)Lgr5與腫瘤細(xì)胞間相互作用有關(guān)，因此認(rèn)為Lgr5與大腸癌干細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2大腸癌干細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路

2.1Wnt/β-catenin信號(hào)通路 Wnt/β-catenin是與大腸癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切的信號(hào)通路，亦是目前干細(xì)胞研究中認(rèn)識(shí)最為清晰的信號(hào)通路之一。主要分為“經(jīng)典的Wnt/β-catenin/TCF”和“非經(jīng)典的Wnt”。正常成熟細(xì)胞β-catenin水平低，Wnt信號(hào)通路處于關(guān)閉狀態(tài)。而腫瘤干細(xì)胞中，β-catenin降解障礙，胞質(zhì)內(nèi)游離β-catenin增多并與TCF/LEF-1結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因c-myc、cyclinD1轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。Vermeulen等[14]發(fā)現(xiàn)在大腸癌干細(xì)胞中，干細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)高度活化，其上游主要靶基因Lgr5高水平表達(dá)，而普通成熟的大腸癌細(xì)胞中β-catenin信號(hào)幾乎不活化，且Lgr5基因表達(dá)水平較低，提示大腸癌干細(xì)胞的形成可能與Wnt/β-catenin信號(hào)的激活有關(guān)。Onishi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞微環(huán)境的刺激下，β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于普通腫瘤細(xì)胞；抑制Wnt信號(hào)通路的活化，可抑制腫瘤細(xì)胞生長。越來越多的證據(jù)[16]證實(shí)β-catenin信號(hào)在腫瘤干細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用。因此，多數(shù)研究認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是抑制腫瘤惡性病變的潛在靶點(diǎn)。

2.2TGF-β信號(hào)通路TGF-β信號(hào)通路可通過特異性結(jié)合并激活具有絲氨酸 / 蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞表面受體啟動(dòng)各種應(yīng)答。通路中包括TGF-β、生長分化因子(GDF)、常見的活化素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。這些轉(zhuǎn)化生長因子能參與多項(xiàng)人體細(xì)胞的活動(dòng), 包括胚胎發(fā)生、免疫、骨骼形成與重建、腫瘤發(fā)生、血管形成、細(xì)胞增殖分化等多種人體生物學(xué)事件。 Akinyi等[17]通過觀察裸鼠腸上皮細(xì)胞標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)阻斷TGF-β信號(hào)通路，可使抑癌基因APC發(fā)生結(jié)構(gòu)突變，最終導(dǎo)致裸鼠發(fā)生侵襲性結(jié)腸腺瘤。而沉默Smad基因之后，TGF-β信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Zubeldia等[18]將高表達(dá)TGF-β1的Mc38細(xì)胞注射到小鼠脾臟，發(fā)現(xiàn)TGF-β1不僅能促進(jìn)原發(fā)腫瘤細(xì)胞的生長，還能促使癌細(xì)胞向肝臟轉(zhuǎn)移，這可能與TGF-β1引起了Mc38細(xì)胞中Smad基因的活化，從而增強(qiáng)細(xì)胞侵襲與遷移能力有關(guān)。Calon等[19]發(fā)現(xiàn)，在大腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移之后，大腸癌組織中包含的干細(xì)胞會(huì)向周圍組織中釋放TGF-β，使得周圍組織中的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-11，從而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變，使得大腸癌細(xì)胞可在異質(zhì)的器官中得以存活。Yu等[20]通過穩(wěn)轉(zhuǎn)，使HCT116細(xì)胞株過度表達(dá)miR-21,發(fā)現(xiàn)TGF-β受體 (TGF-βR2)表達(dá)下調(diào)，而細(xì)胞株中干細(xì)胞比例增加，干細(xì)胞球的形成能力亦隨之增強(qiáng)。

2.3Hedgehog信號(hào)通路 Hedgehog信號(hào)通路是調(diào)控胚胎發(fā)育的一條經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的增殖和分化方面亦扮演重要角色[21]。Hedgehog是一種跨膜蛋白受體復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hedgehog與受體Ptc結(jié)合時(shí)，Hedgehog對(duì)下游Smoothened (Smo)激酶的抑制效應(yīng)被解除，Smo被激活使得下游Gli因子的降解作用被抑制，Gli繼而從復(fù)合體中釋放出來以全長的形式進(jìn)入細(xì)胞核中啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)[22]。多數(shù)研究已證實(shí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤及慢性髓樣白血病等的腫瘤干細(xì)胞均受到Hedgehog通路的調(diào)節(jié)作用，抑制這些細(xì)胞中HH通路的活性可明顯降低其致瘤能力。有研究發(fā)現(xiàn)，DDE(一種含氯的污染物)通過激活Hedgehog/Gli通路，能增加人結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新和分化、重建成結(jié)腸癌細(xì)胞群體的能力[23]。說明Hedgehog信號(hào)通路在維持腫瘤干細(xì)胞干性及調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)方面起著重要作用。Yoshimoto等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Hodgehog信號(hào)通路對(duì)大腸癌細(xì)胞功能起調(diào)控作用，這一作用表現(xiàn)在促進(jìn)炎癥信號(hào)衰減和拮抗細(xì)胞凋亡兩方面，而這兩方面對(duì)于維持了促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖的腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要調(diào)控作用。

2.4Notch信號(hào)通路 Notch 通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展中研究較多的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)化上高度保守，在維持細(xì)胞增殖、分化與凋亡間的動(dòng)態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用。一個(gè)完整的Notch信號(hào)通路包括Notch受體、Notch配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子CSL 蛋白、Notch靶基因、其他效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等。研究[25]發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch通路可致人體內(nèi)造血干細(xì)胞的減少和體外造血干細(xì)胞分化的加速，這提示Notch通路可能使胞核內(nèi)與胞質(zhì)內(nèi)的相關(guān)蛋白結(jié)合，抑制與分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。Fender等[26]發(fā)現(xiàn)，Notch-1可通過促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化，從而維持大腸癌干細(xì)胞的多向分化潛能。此外，激活Notch信號(hào)通路，大腸隱窩細(xì)胞的分化能力降低，而大腸干細(xì)胞的增殖能力卻明顯提高[27]。研究證明[28]敲除Notch基因會(huì)使結(jié)腸癌干細(xì)胞喪失成瘤能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。當(dāng)將Notch信號(hào)通路的受體基因敲除后(特別是Notch2)，會(huì)引起其下游的Met原癌基因、干性轉(zhuǎn)錄因子Oct4與Nanog及CD44表達(dá)明顯下調(diào)[29]。Notch信號(hào)通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等方面有重要調(diào)控作用。因此Notch信號(hào)通路上的基因，有可能成為將來大腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。

3大腸癌干細(xì)胞的其他標(biāo)記物及信號(hào)通路

腫瘤干細(xì)胞理論已在相關(guān)腫瘤中得到證實(shí)，但對(duì)它的研究尚處于初步階段。因此作為干細(xì)胞標(biāo)記物的基因和活化的信號(hào)通路，正在被不斷發(fā)現(xiàn)。例如，CD24通過上調(diào)Src(酪氨酸激酶家族)，可激活ERK和PMAPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化，提示CD24亦是分選結(jié)腸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記物之一[30，31]。在信號(hào)通路調(diào)控大腸癌干細(xì)胞的研究中，人們也逐漸發(fā)現(xiàn)這些通路之間并不是相互獨(dú)立的，上述Wnt、Hedgehog和Notch三條信號(hào)通路之間即存在著復(fù)雜的串聯(lián)。有研究表明Gli的活化能刺激Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄，同樣暗示W(wǎng)nt此時(shí)相當(dāng)于Hedgehog的下游通路。然而，在某些病理應(yīng)答中，Wnt通路中的分子如GSK-3β和β-catenin，同樣也調(diào)節(jié)著Hedgehog通路中的特異位點(diǎn)。因此，有學(xué)者認(rèn)為，Wnt、TGF-β、Notch、Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組成了復(fù)雜的干細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，并且推測該體系可能還遠(yuǎn)不止目前這些。而這些網(wǎng)絡(luò)之間的平衡對(duì)于干祖細(xì)胞的保持有重要意義，破壞這種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可能導(dǎo)致病理變化而發(fā)生腫瘤。

綜上所述，對(duì)正常干細(xì)胞分選標(biāo)記物及信號(hào)傳導(dǎo)通路的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，使我們對(duì)大腸癌干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有了更深入的了解。但目前仍有很多問題有待明確：第一、目前尚未發(fā)現(xiàn)具有代表性和有較高特異性的大腸癌干細(xì)胞標(biāo)記物，而標(biāo)記物形成的生物學(xué)機(jī)制亦丞待明確；第二，大腸癌干細(xì)胞來源及維持其自我更新能力的機(jī)制仍未明確；第三，大腸癌的發(fā)病常為多因素所致，而大腸癌干細(xì)胞在其中起何種作用，目前仍不明確；第四，如何特異性殺死大腸癌干細(xì)胞，而不損傷正常大腸組織，從而實(shí)現(xiàn)真正的靶向治療，目前尚缺乏有效的實(shí)施方法。因此，進(jìn)一步深入研究大腸癌干細(xì)胞的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及生物學(xué)特性的分子機(jī)制，對(duì)于提高大腸癌的預(yù)防、診斷、治療水平有重要意義。

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