人類(lèi)唾液組學(xué)在腫瘤診斷的應(yīng)用價(jià)值

鄭建洲, 俞小衛(wèi)

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003)

關(guān)鍵詞:唾液; 唾液組學(xué); 腫瘤; 診斷; 價(jià)值

近年來(lái)，科學(xué)家認(rèn)為對(duì)唾液的分析將有助于腫瘤的診斷和早期治療。唾液是一種復(fù)雜的混合物，儲(chǔ)存了大量的宿主和口腔微生物基因信息以及翻譯后水平調(diào)控信息，能夠反映全身系統(tǒng)性疾病信使核糖核酸和蛋白質(zhì)變化的重要物質(zhì)[1]。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，體內(nèi)某些中介因子的作用可使唾液中的某些生物大分子的表達(dá)譜發(fā)生特征性的改變，而這些分子可作為其唾液生物靶標(biāo)分子用于臨床診斷。

隨著基因表達(dá)芯片、蛋白質(zhì)芯片、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和全基因組測(cè)序等高度敏感性和高通量技術(shù)的快速發(fā)展，學(xué)者們已經(jīng)在唾液中發(fā)現(xiàn)了許多臨床疾病的特異性生物標(biāo)志物[2-4]。Wong等[5]建立了唾液組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(SKB)，系統(tǒng)性地搜集唾液組學(xué)的數(shù)據(jù)資料。SKB是目前唯一致力于唾液組學(xué)的網(wǎng)站，儲(chǔ)存了大量人類(lèi)唾液生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等研究方面的信息。唾液組學(xué)涵蓋了唾液基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)及微生物組學(xué)等，反映了全身系統(tǒng)性疾病DNA、RNA和蛋白質(zhì)變化的多樣性。本文對(duì)唾液組學(xué)包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展及其在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行綜述。

1唾液組學(xué)

1.1　唾液基因組學(xué)

唾液基因組主要包含人類(lèi)、口腔微生物和病毒DNA。唾液中人類(lèi)DNA大約占70%，口腔微生物和病毒DNA占30%左右，而口腔黏膜細(xì)胞是人類(lèi)DNA的主要來(lái)源。與血液基因組DN(7.4 μg/mL)相比，唾液全基因組DNA(7.8 mg/mL)產(chǎn)量更高。而唾液和血液基因組DNA具有高純度，兩者的基因分型結(jié)果一致性為100%[6]。但由于唾液易于收集、儲(chǔ)存方便，唾液DNA更有利于基因分型、測(cè)序和甲基化研究[7-9]。

1.2　唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)

唾液RNA水平在(0.108±0.023) μg/mL到(6.6±3.6) μg/mL。大部分唾液RNA來(lái)源于人類(lèi)RNA，目前檢測(cè)出3 000～6 400種人類(lèi)唾液RNA，其中200種RNA為唾液轉(zhuǎn)錄本核心(NSCT)，為不同個(gè)體所共有成分[10]。研究[11]表明唾液RNA由于其轉(zhuǎn)錄本3′區(qū)富含AU元件，能夠結(jié)合蛋白使其十分穩(wěn)定，是比較理想的唾液標(biāo)志物來(lái)源。

人類(lèi)唾液中非編碼RNA主要包含小分子RNA(miRNAs)、與piwi蛋白相互作用RNA(piRNAs)和循環(huán)RNA(circRNAs)。一項(xiàng)對(duì)非編碼RNA的深入研究表明，與血清和腦脊液相比，人類(lèi)唾液中miRNA和piRNA具有更高的豐度，且相對(duì)穩(wěn)定[12], 是轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較理想的研究來(lái)源。

1.3　唾液蛋白組學(xué)

唾液蛋白質(zhì)組學(xué)主要以二維凝膠電泳(2D-DIGE)聯(lián)合質(zhì)譜(MS)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)記物[13]。研究者[2,14]利用表面增強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)和液相質(zhì)譜等技術(shù)，分別檢測(cè)出253種和200種蛋白質(zhì)，其中有22.8%～28.7%的檢測(cè)蛋白未知功能。最近，研究者[15]提出了一種高通量的多元蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)，在蛋白芯片中包含與宿主防御、炎癥組織損壞和血管相關(guān)的30種標(biāo)志物。

1.4　唾液代謝組學(xué)

與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)一樣，唾液代謝組學(xué)也能通過(guò)代謝產(chǎn)物的定量分析，監(jiān)測(cè)與疾病相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。Sugimoto等[16]發(fā)現(xiàn)了多種唾液代謝產(chǎn)物用于口腔癌、乳腺癌和胰腺癌的檢測(cè)。在口腔癌患者的唾液中發(fā)現(xiàn)了28種特異性代謝產(chǎn)物，其中聚胺、鳥(niǎo)氨酸和腐胺的水平顯著升高；在胰腺癌患者的唾液中發(fā)現(xiàn)了48種特異性標(biāo)志物，其中色氨酸和精氨酸明顯升高，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸顯著降低；在乳腺癌患者的唾液中發(fā)現(xiàn)了28種特異性代謝產(chǎn)物，其中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和賴氨酸的水平明顯下降。

2唾液組學(xué)在腫瘤診斷中的應(yīng)用

在過(guò)去的10年中，肺癌檢測(cè)生物標(biāo)志物的研究集中在對(duì)支氣管肺泡灌洗液(BAL)、支氣管上皮細(xì)胞、血液或活檢組織的分析[17]。隨著基因表達(dá)芯片、蛋白質(zhì)芯片、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和全基因組測(cè)序等高度敏感性和高通量技術(shù)的快速發(fā)展，學(xué)者們能夠在唾液中發(fā)現(xiàn)許多與腫瘤相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物。

2.1　口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物

晚期口腔癌肉眼就可以鑒別，而由于早期口腔癌不能及時(shí)診斷，而導(dǎo)致晚期口腔癌治療預(yù)后差。研究者通常用唾液組學(xué)(代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))來(lái)尋找口腔癌中唾液標(biāo)志物，用于早期口腔癌的檢測(cè)[18]。已報(bào)道[15, 19-20]的口腔癌唾液獨(dú)立標(biāo)志物有內(nèi)皮素受體B(EDNRB)、miR-200a、miR-125a和miR-31和IL-8蛋白，但只有IL-8靈敏度和特異性較高，可用于口腔癌的檢測(cè)[11]。

多種唾液標(biāo)志物聯(lián)合模型診斷口腔癌更為可靠。一項(xiàng)前瞻性病例-對(duì)照研究[21]中，用已報(bào)道的7種口腔癌RNA標(biāo)志物對(duì)395個(gè)受試者唾液進(jìn)行檢測(cè)，其中3種RNA標(biāo)志物(IL8、IL1B和SAT)的靈敏度和特異性較高，分別為0.68、0.65、0.66和0.64、0.60、0.63。而4種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)下的受試者工作曲線下面積(AUC)范圍在0.74～0.86。Jou等[22]利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)比較口腔癌受試者和非口腔癌受試者唾液蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)口腔癌患者唾液中轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。研究者通過(guò)ELISA方法證實(shí)了口腔癌唾液中轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)表達(dá)，且在口腔癌T1期的敏感度和特異性達(dá)到100%。而用毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)的57個(gè)代謝標(biāo)志物，多因素回歸分析代謝標(biāo)志物在口腔癌、乳腺癌、胰腺癌和牙周病診斷中的AUC分別為0.865、0.973、0.993和0.969[16]。

2.2　肺癌標(biāo)志物

肺癌的發(fā)病率和致死率高居各類(lèi)癌癥之首，而且由于肺癌早期無(wú)癥狀或非特異性癥狀，高于75%的肺癌在中晚期被診斷，主要?dú)w根于還沒(méi)有切實(shí)可行的辦法檢測(cè)和篩選高危人群[23]。目前，主要依賴胸片X光片、低劑量螺旋CT，因檢測(cè)成本較高無(wú)法惠及更多的病人，支氣管內(nèi)鏡和活檢等檢測(cè)手段對(duì)肺癌具有確診意義[24-25]，但作為有創(chuàng)性檢查尚不能作為人群普查的主要方式。因此發(fā)展新的早期診斷策略，研究非侵襲性的生物標(biāo)記新技術(shù)已迫在眉睫。

Zhang等[4]用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了10例肺癌患者和10例對(duì)照的唾液，與對(duì)照唾液RNA相比，肺癌患者唾液RNA中有593個(gè)基因表達(dá)上調(diào)5倍以上，585個(gè)基因表達(dá)下調(diào)5倍以上，從中選擇了肺癌RNA上調(diào)表達(dá)最多的16個(gè)RNA作為候選標(biāo)志物。通過(guò)96個(gè)唾液樣本(32個(gè)肺癌和64個(gè)對(duì)照)中進(jìn)行盲性反轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證，有7個(gè)RNA標(biāo)志物AUC在0.707～0.85。而其中5個(gè)RNA標(biāo)志物(CCNI、EGFR、FGF19、FRS2和GREB1)聯(lián)合檢測(cè)模型的AUC為0.925, 敏感度和特異性分別為93.75%和82.81%。

一項(xiàng)肺癌和對(duì)照唾液樣本的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[2]發(fā)現(xiàn)，有253個(gè)蛋白點(diǎn)有顯著性差異，其中有3個(gè)蛋白質(zhì)(hp2、zinc α2-glycoprotein和annexin A1)被證實(shí)可作為區(qū)別肺癌和健康人群的標(biāo)志物，對(duì)肺癌陽(yáng)性預(yù)測(cè)值92%，對(duì)健康人群的陰性預(yù)測(cè)值88.9%。多標(biāo)志物的回歸分析顯示其具有較高的靈敏度(73.1%)和特異性(96.2%)。

近些年，表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)得到了應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)唾液拉曼峰值的差別來(lái)區(qū)分肺癌患者和正常人群，但其敏感性和特異性還未得到證實(shí)[26]。

2.3　胰腺癌標(biāo)志物

一個(gè)重要的腫瘤檢測(cè)里程碑事件是Zhang等[27]的唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，首次將臨床上前瞻性隨機(jī)開(kāi)放式盲法終點(diǎn)(ProBE)研究設(shè)計(jì)應(yīng)用到胰腺癌檢測(cè)上來(lái)，證實(shí)了唾液RNA可用于檢測(cè)早期胰腺癌。研究人員先通過(guò)唾液轉(zhuǎn)錄譜找到胰腺癌(n=12)和健康人群(n=12)唾液中表達(dá)差異RNA標(biāo)志物，定量PCR證實(shí)了其中6個(gè)上調(diào)表達(dá)和3個(gè)下調(diào)表達(dá)的RNA標(biāo)志物。在30個(gè)胰腺癌和60個(gè)對(duì)照標(biāo)本驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)其AUC在0.661～0.791, 而其中4個(gè)RNA標(biāo)志物聯(lián)合預(yù)測(cè)模型的AUC超過(guò)了0.971。通過(guò)此項(xiàng)研究，證實(shí)了唾液RNA可用于胰腺癌的檢測(cè)，也為臨床檢測(cè)提供了新的預(yù)測(cè)模型。

唾液代謝產(chǎn)物也可用于胰腺癌的診斷，通過(guò)毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)的48個(gè)唾液代謝產(chǎn)物作為胰腺癌候選標(biāo)志物，其中5個(gè)代謝產(chǎn)物做多因素回歸模型后，其AUC為0.944[16]。有研究發(fā)現(xiàn)口腔細(xì)菌譜的變化與胰腺癌等疾病也有相關(guān)性，可用于胰腺癌和胰腺炎的鑒別診斷[28]。

2.4　乳腺癌標(biāo)志物

對(duì)癌癥，如乳腺癌的早期診斷也在最近提出。其理論基礎(chǔ)為，在某些全身性疾病如腫瘤發(fā)生過(guò)程中，體內(nèi)某些中介因子的作用可使唾液中的某些生物大分子的表達(dá)譜發(fā)生特征性的改變，通過(guò)發(fā)現(xiàn)這些變化臨床診斷出癌癥。

早期研究[29]發(fā)現(xiàn)c-erbB-2蛋白是目前病理學(xué)診斷乳腺癌的重要標(biāo)志物，也是術(shù)后復(fù)發(fā)評(píng)估的重要指標(biāo)。研究者[30-31]在唾液和血清中也得到了相同的結(jié)果，與正常人群相比，乳腺癌中唾液的c-erbB-2蛋白水平更高，但是主要用于晚期乳腺癌的診斷，對(duì)于早期乳腺癌檢測(cè)靈敏度不高。

近年來(lái)興起的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)可同時(shí)分析八重蛋白質(zhì)樣本，已成為高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)的主要手段之一。Cao等[32]收集了20個(gè)乳腺癌和10個(gè)健康人群的唾液，用iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)了464個(gè)蛋白質(zhì)，其中有9個(gè)蛋白質(zhì)差異相差1.5倍，在早期乳腺癌的診斷中被證實(shí)具有較高的靈敏度和特異性。

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收稿日期:2015-01-20

中圖分類(lèi)號(hào):R 730.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)15-200-03

DOI:10.7619/jcmp.201515071