周新強，韓倩倩，朱艷琴

(1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2012級碩士研究生，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

·實驗研究·

α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞系Eca-109細(xì)胞凋亡及機制的研究*

周新強1，韓倩倩2，朱艷琴2

(1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2012級碩士研究生，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

目的：研究α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞Eca-109凋亡及其機制。方法：MTT法檢測α-細(xì)辛醚對Eca-109細(xì)胞活力影響；AO/EB熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞分析檢測α-細(xì)辛醚對Eca-109細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；蛋白質(zhì)印跡法檢測誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的相對表達量。結(jié)果：MTT檢測表明，α-細(xì)辛醚能夠抑制Eca-109細(xì)胞的增殖，且隨α-細(xì)辛醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和作用時間的延長而增強(P<0.05)。AO/EB染色可以看到，經(jīng)α-細(xì)辛醚作用的細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮現(xiàn)象，被染成綠色或橘紅色。流式細(xì)胞儀檢測顯示，α-細(xì)辛醚作用24 h后，其凋亡指數(shù)隨藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而相應(yīng)增加，實驗組凋亡指數(shù)和陰性對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。蛋白印跡法檢測結(jié)果表明，α-細(xì)辛醚作用24 h后，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的相對表達量上調(diào)，與陰性對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：α-細(xì)辛醚能促進Eca-109細(xì)胞的凋亡，其機制可能與上調(diào)caspase-3和caspase-9的表達有關(guān)。

食管癌；α-細(xì)辛醚；細(xì)胞凋亡

在世界大范圍內(nèi)居惡性腫瘤病死率第7位[1]的食管癌在中國的發(fā)病率居第4位，嚴(yán)重威脅了人類的健康。目前食管癌發(fā)病的分子機制尚沒有標(biāo)準(zhǔn)闡述，臨床治療上仍找不到有效的靶向分子，因此，發(fā)現(xiàn)與其發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系密切的基因異常變化，深入研討食管癌的發(fā)病機制，開展新基因的治療策略顯得尤為重要。α-細(xì)辛醚是天南星科植物石菖蒲揮發(fā)油的主要成分，揮發(fā)油是石菖蒲鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥作用的主要有效部位。近年來，關(guān)于α-細(xì)辛醚的抗腫瘤作用有少量報道[2-3]，本研究主要研究α-細(xì)辛醚促Eca-109細(xì)胞凋亡作用，進而探討α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)Eca-109凋亡的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 癌株來源

人食管癌細(xì)胞系Eca-109購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 藥品、試劑與儀器

α-細(xì)辛醚，購自山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號HZ20051775。RPMI1640培養(yǎng)基，購于Thermo公司，批號MJZ1225；胎牛血清，購自杭州四季青公司，批號140511；四甲基偶氮唑鹽(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)，Sigma公司產(chǎn)品，批號0793；二甲基亞砜(DMSO)、AO/EB，均為Solarbio公司產(chǎn)品，批號依次是D8307，AB5468；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，BD公司產(chǎn)品，批號556547；caspase-3(批號1087-1)、caspase-9(批號1023-1)和羊抗兔HRP-IgG抗體(批號1058-1)，均購自Abcam公司；β-ACTIN，購自博士的公司，批號BA2305。IX73型熒光倒置顯微,Olympus公司產(chǎn)品；C6型流式細(xì)胞儀,Becton Dickinson公司產(chǎn)品；UNIVERSAL型免疫印跡設(shè)備,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管癌109細(xì)胞株，用含體積分?jǐn)?shù)100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、50 mL/L CO2、相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 Eca-109細(xì)胞活力

采用MTT細(xì)胞活力實驗。取對數(shù)生長期的109細(xì)胞，以每孔200 μL(5×103個/孔)接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(100, 50, 25 mg/L)的α-細(xì)辛醚，每孔200 μL；陰性對照組加入相同體積的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)12h、24 h、36 h和48 h。每個時間點后加入MTT(5 g/L、20 μL)，繼續(xù)孵育4h；小心吸取上清液，每孔加進150 μL的DMSO，平板振動器振搖15 min；通過波長490 nm的酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔的吸光值，計算體外增殖抑制率。實驗重復(fù)3次。

1.4.2 細(xì)胞的凋亡形態(tài)

采用AO/EB法觀察。收集以質(zhì)量分?jǐn)?shù)25 mg/L 和50 mg/L α-細(xì)辛醚作用24 h、48h的Eca-109細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞；PBS洗滌細(xì)胞2遍，吸去上清；留少量細(xì)胞沉淀，加50 μL PBS重懸；AO、EB染液等體積混勻；吸取細(xì)胞懸液25 μL，加進1 μL的AO/EB染液混勻；吸混合液10μL，滴加到載玻片，蓋上蓋玻片，在510 nm激發(fā)光下用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.3 細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞經(jīng)傳代后接種于培養(yǎng)瓶中，孵育細(xì)胞至貼壁后，取出上清液。根據(jù)實驗再分別加入完全培養(yǎng)基和α-細(xì)辛醚，繼續(xù)孵育24 h。收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，加進預(yù)冷的700 mL/L 乙醇，輕吹懸細(xì)胞之后于4 ℃冰箱過夜。取單細(xì)胞懸液1×106/mL，加入3 mL PBS洗滌兩遍,加入500 μL 的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5 μL的Annexin V-FITC染液混勻，加入5 μL PI染液，混勻；避光室溫孵育5～15 min，上機檢測。

1.4.4 凋亡相關(guān)蛋白相對表達量

收集經(jīng)處理的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)120 g/L 聚丙烯酰胺分離膠和50 g/L 的濃縮膠，將經(jīng)過處理的樣品和上樣緩沖液以每空15 μL的體積加入上樣孔；以一定的電壓電泳，用半干轉(zhuǎn)法將蛋白由膠轉(zhuǎn)至NC膜上；經(jīng)過脫脂奶粉的封閉、一抗和二抗的孵育，加入ECL發(fā)光液孵育3 min；暗室壓片進行曝光，凝膠成像儀掃片出結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組Eca-109細(xì)胞活力對比

α-細(xì)辛醚在25～100 mg/L范圍內(nèi)，各藥物分別作用細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h，均能抑制Eca-109細(xì)胞增殖，且增殖抑制率從17.04%逐漸提高至80.68%，且隨著藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和作用時間的延長，細(xì)胞的增殖抑制率呈增高趨勢。表明：α-細(xì)辛醚對Eca-109細(xì)胞的增殖抑制具有時間-藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)依賴性。見表1。

表1 各組Eca-109體外增殖抑制率對比 %

2.2 各組Eca-109細(xì)胞凋亡形態(tài)對比

倒置顯微鏡下：陰性對照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，細(xì)胞分布密集，形態(tài)飽滿、規(guī)則，呈圓形及橢圓形，細(xì)胞邊界清楚。α-細(xì)辛醚各劑量組可見明顯的細(xì)胞形態(tài)改變，隨著藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，圓細(xì)胞的數(shù)目明顯增多，原本貼壁生長的細(xì)胞最后變成懸浮狀態(tài)，體積變小，細(xì)胞的間隙變大。熒光顯微鏡下：陰性對照組染色質(zhì)被染成綠色，呈正常結(jié)構(gòu)。經(jīng)α-細(xì)辛醚處理的一部分細(xì)胞的核染色質(zhì)呈凝結(jié)狀，被染成綠色或橘紅色，為早期凋亡和晚期凋亡。見圖1、圖2。

圖1 倒置顯微鏡下各組Eca-109細(xì)胞形態(tài)(×100)

圖2 AO/EB染色后熒光顯微鏡下各組Eca-109細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.3 各組Eca-109細(xì)胞凋亡指數(shù)對比

α-細(xì)辛醚25，50 mg/L組平均凋亡指數(shù)依次為(2.93±0.05)和(5.02±0.04)，與陰性對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。α-細(xì)辛醚兩個劑量組之間的Eca-109細(xì)胞凋亡指數(shù)對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組Eca-109細(xì)胞凋亡指數(shù)對比

表2 各組Eca-109細(xì)胞凋亡指數(shù)對比

組 別樣本數(shù)凋亡指數(shù)陰性對照組30．602±0．06α-細(xì)辛醚25mg·L-1組32．93±0．05??α-細(xì)辛醚50mg·L-1組35．02±0．04??##

注：與陰性對照組對比，**P<0.01；與α-細(xì)辛醚25 mg·L-1組對比，##P<0.01。

2.4 各組Eca-109細(xì)胞內(nèi)24 h caspase-3、caspase-9相對表達量對比

α-細(xì)辛醚25，50mg/L組Eca-109細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9相對表達量均隨藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增高，與陰性對照組對比，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組Eca-109細(xì)胞24h caspase-3、caspase-9相對表達量對比

表3 各組Eca-109細(xì)胞24h caspase-3、caspase-9相對表達量對比

組 別樣本數(shù)caspase?3/β?actincaspase?9/β?actin陰性對照組30．664±0．0040．364±0．003α-細(xì)辛醚25mg·L-1組30．896±0．006?0．510±0．003??α-細(xì)辛醚50mg·L-1組31．087±0．007?0．616±0．005??

注：與陰性對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤是近幾年腫瘤研究的熱點之一[4-5]。通過高效、低毒的中藥及其有效成分的篩選、從中發(fā)現(xiàn)中西醫(yī)抗腫瘤治療結(jié)合點、探索研究抗腫瘤的分子機制是當(dāng)前重點發(fā)展方向。α-細(xì)辛醚是中藥石菖蒲的主要活性成分之一，存在于石菖蒲揮發(fā)油中，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對神經(jīng)系統(tǒng)[6]、循環(huán)系統(tǒng)[7]、呼吸系統(tǒng)[8]、消化系統(tǒng)的影響和抗氧化作用均已得到證實，尤其側(cè)重于支氣管哮喘[9-10]、支氣管肺炎[11-12]、降血脂[13]等方面的作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子在一系列的內(nèi)源性基因的作用下引發(fā)的自然或物理的死亡過程，是由一系列因素的調(diào)節(jié)和控制下的“瀑布式”的反應(yīng)過程。根據(jù)細(xì)胞啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同部分，可將其分為死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和線粒體通路3條不同介導(dǎo)的凋亡通路[14]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族是線粒體凋亡途徑的重要內(nèi)容，caspase家族分為兩大類，一是上游的起動者，有caspase-8，10 等；另一種是包括下游執(zhí)行的Caspase-3，6，7[15]。細(xì)胞色素C從凋亡細(xì)胞的線粒體內(nèi)釋放，凋亡蛋白酶活化因子和其結(jié)合，進而活化caspase-9的前體[16]，隨后激活Caspase-3蛋白前體，緊接著通過DNA修復(fù)酶以及具有結(jié)構(gòu)、信號或轉(zhuǎn)錄功能的蛋白質(zhì)激活而裂解，從而導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡[17]。

本研究中，α-細(xì)辛醚對Eca-109細(xì)胞具有明顯的抑制作用，其作用與劑量和作用時間呈正相關(guān)。α-細(xì)辛醚作用24 h和48 h后熒光顯微鏡下可見明顯的凋亡形態(tài)；且其作用于Eca-109細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率增加，凋亡相關(guān)蛋白( caspase-3、 caspase-9)的表達量亦增加，可以推測：α-細(xì)辛醚處理109細(xì)胞后，細(xì)胞色素c的釋放，和凋亡蛋白酶活化因子的結(jié)合，活化了caspase-9的前體，隨后激活了casease-3前體變?yōu)閏asease-3，緊接著通過DNA修復(fù)酶以及具有結(jié)構(gòu)、信號或轉(zhuǎn)錄功能的蛋白質(zhì)激活而裂解，從而導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡，完成了一次典型的線粒體途徑凋亡。

綜上所述，α-細(xì)辛醚對人食管癌細(xì)胞系Eca-109促凋亡作用明顯，并具有時間-劑量關(guān)系，該作用可能是通過經(jīng)典的線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0061-05

R735.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.30

朱艷琴，醫(yī)學(xué)碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，jc.zyqin@163.com；

鄭州市重大科技攻關(guān)攻關(guān)項目(131PCXTD520)；鄭州市創(chuàng)新科技團隊(121PCXTD520)

2014-10-13；

2015-01-09