席雷，李彤

(天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院，泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院，天津300070)

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)心肌組織中存在的心臟干細(xì)胞(CSCs)能夠分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，具有較高的分化效率［1］。此外，CSCs由多個(gè)亞群組成，不同亞群的CSCs對(duì)心臟損傷修復(fù)有不同的作用。然而，目前關(guān)于CSCs分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象以鼠為主，缺少對(duì)人心肌組織CSCs(hCSCs)的研究，且CSCs數(shù)量較少，體外培養(yǎng)困難［2］。因此，2013年10月～2014年10月，本研究探討了獲取hCSCs的影響因素，并分析了hCSCs的亞群特征。

1 材料與方法

1.1 材料 組織來(lái)源:選取30例先天性心臟病患兒，男17例、女13例，年齡9個(gè)月～11歲(4.11±3.31)歲。術(shù)前與患者家屬簽訂知情同意書，并保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合倫理要求。在術(shù)中體外循環(huán)前，切取右心耳組織50 mg用于分離培養(yǎng)hCSCs。主要儀器及試劑:胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶(worthing公司，美國(guó));抗體干細(xì)胞因子受體酪氨酸激酶(c-Kit)、胰島素基因增強(qiáng)蛋白質(zhì)(Isl-1)(SantaCruz公司，美國(guó));細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司，美國(guó));免疫熒光共聚焦顯微鏡(Leica，美國(guó));流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 hCSCs的分離與培養(yǎng) 將右心耳組織置于轉(zhuǎn)移液中，整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間小于30 min。去除表面脂肪組織后，將右心房組織剪成體積為1 mm3的碎塊，使用PBS沖洗2次、每次3 min。將組織碎塊置于含有0.05%胰酶以及0.1%Ⅰ型膠原酶的20 mL D-Hank＇s液內(nèi)，在37℃恒溫振蕩器上低頻振蕩，消化5 min后，通過(guò)80目尼龍篩網(wǎng)，重新收集組織塊，置于纖維蛋白包被的培養(yǎng)皿中，加入完全組織培養(yǎng)基0.5 mL，室溫孵育1 h，再加入完全組織培養(yǎng)基1 mL后，放入37℃、5%CO2的孵箱中孵育，3～4 d更換一次培養(yǎng)基。孵育2周后，可見(jiàn)圓亮細(xì)胞出現(xiàn)。收集成團(tuán)的圓亮細(xì)胞，用含有EDTA的PBS溶液沖洗2次，加入0.05%胰酶消化5 min后終止消化，將圓亮細(xì)胞接種在多聚D賴氨酸包被的孔板中，并在每個(gè)孔板中滴加500 μL心肌球培養(yǎng)基。收集心肌球接種至纖維蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)并用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光共聚焦染色觀察c-Kit+、Isl-1+細(xì)胞的表達(dá)情況 細(xì)胞滴加至纖維蛋白包被的腔室玻片孔中，并以4%多聚甲醛固定。室溫下，固定的細(xì)胞以含有10%山羊血清和0.1%Tween PBS溶液封閉 1 h，一抗孵育(c-Kit，1∶500;Isl-1，1∶500)，4 ℃過(guò)夜。PBS浸泡2次，每次5 min，吸水紙吸去液體，滴加二抗。使用含有DAPI的中性樹(shù)膠封片。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察切片。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析c-Kit+及Isl-1+細(xì)胞的比例 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hCSCs，用含0.5%BSA的PBS沖洗。將細(xì)胞懸液加在EP管中，待測(cè)細(xì)胞數(shù)≥105。在 EP管中分別加入抗體 c-Kit、Isl-1 2 μL，充分混勻，4℃避光孵育30 min，離心棄上清，PBS洗滌后再次離心棄上清。4%多聚甲醛400 μL重懸，移至流式上樣管，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用Pearson法分析年齡、性別與hCSCs數(shù)量的相關(guān)性。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hCSCs分離培養(yǎng)的影響因素 培養(yǎng)心肌組織塊1周后，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣爬出;2周后，在成纖維細(xì)胞層上出現(xiàn)圓亮細(xì)胞附著。每50 mg心肌組織中可獲取(2.31±1.23)×104個(gè)hCSCs。經(jīng)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，hCSCs數(shù)量與年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.869，P＜0.01)，與性別無(wú)相關(guān)性(r=0.027，P=0.87)。

2.2 hCSCs中c-Kit+、Isl-1+細(xì)胞所占比例 hCSCs Isl-1、c-Kit均陽(yáng)性表達(dá)。在1×105的數(shù)量級(jí)中，Isl-1+細(xì)胞占(1.21±0.37)%，c-Kit+細(xì)胞占(3.28±0.94)%。

3 討論

hCSCs表達(dá)胚胎及干細(xì)胞相關(guān)抗原，然而其數(shù)量有限且提取過(guò)程繁瑣，進(jìn)而制約了關(guān)于hCSCs的基礎(chǔ)及臨床研究。因此，如何獲取及培養(yǎng)hCSCs是當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。心室、主動(dòng)脈根部及右室流出道的心肌組織常用于獲取hCSCs。然而，相比其他心肌位置，手術(shù)中獲取右心耳組織方便，風(fēng)險(xiǎn)較低;且切除部分組織后對(duì)心功能影響不大。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)右心耳組織中可獲取hCSCs，且形態(tài)良好，擴(kuò)增穩(wěn)定，因此，右心耳是獲取hCSCs的首選位置。

目前有兩種常用的hCSCs分離培養(yǎng)方法，即組織塊分離培養(yǎng)法和心肌球培養(yǎng)法。本研究采用的方法是后者。雖然有學(xué)者提出，心肌球培養(yǎng)法需要特定的心肌球生長(zhǎng)培養(yǎng)液以及多種細(xì)胞因子，費(fèi)用昂貴［3］;但對(duì)于從幼兒右心耳提取原代hCSCs來(lái)講，可較大程度上獲取并保留具有多向分化特性的細(xì)胞。

Miyamoto等［4］從鼠心臟組織內(nèi)成功分離了 c-Kit+細(xì)胞，這些細(xì)胞在傳代40代后，依然具有干細(xì)胞特性并能分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。c-Kit+細(xì)胞在5-氮雜胞苷作用下分化為心肌細(xì)胞［5］，進(jìn)一步說(shuō)明c-Kit+細(xì)胞是hCSCs的一類亞群。Isl-1+細(xì)胞參與心臟第二心區(qū)形成，在對(duì)鼠胚胎期細(xì)胞系示蹤分析中發(fā)現(xiàn)，在參與胚胎期心臟形成的細(xì)胞中，2/3以上的細(xì)胞屬Isl-1+［6］。大部分Isl-1+細(xì)胞定位于流出道并分化為心肌細(xì)胞，表達(dá)肌鈣蛋白T及α平滑肌肌動(dòng)蛋白［7］。本研究結(jié)果顯示，hCSCs中c-Kit與Isl-1均陽(yáng)性表達(dá)，以c-Kit+細(xì)胞為主。

有研究表明，供體的生理狀態(tài)及組織來(lái)源決定了獲取hCSCs的數(shù)量［8］。其中年齡是主要影響因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，不但心肌組織中hCSCs的數(shù)量減少，且向心肌細(xì)胞分化的能力減弱［8，9］。本研究支持以上文獻(xiàn)。因此，嬰幼兒心肌組織是獲取hCSCs的最佳來(lái)源。

應(yīng)用hCSCs向心肌細(xì)胞分化及旁分泌的特點(diǎn)治療小兒心力衰竭成為當(dāng)前研究方案之一。非心源性干細(xì)胞的細(xì)胞核的轉(zhuǎn)分化過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)、效率較低，且獲得的表型不夠明確。hCSCs可直接分化為心臟的組成部分，更適宜治療心力衰竭。最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，2億個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與1百萬(wàn)個(gè)c-Kit+細(xì)胞分別植入心肌梗死模型后，其臨床效果相似，而c-Kit+細(xì)胞有更強(qiáng)的再生能力。

對(duì)hCSCs的研究可豐富干細(xì)胞移植治療心血管疾病的方法，并且對(duì)解釋心臟的起源與發(fā)育具有極為重要的意義。由于實(shí)驗(yàn)的局限性，本研究?jī)H對(duì)hCSCs的分離培養(yǎng)及其與年齡、性別的相關(guān)性、亞群比例作出初步分析，在hCSCs分化為心肌細(xì)胞的機(jī)制等問(wèn)題上需要進(jìn)一步的研究。

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