趙嚴冬，王建(徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，江蘇徐州221004)

IL-17對乳腺癌細胞侵襲力的影響及機制

趙嚴冬，王建
(徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，江蘇徐州221004)

摘要:目的探討IL-17對人乳腺癌細胞侵襲能力的影響及其可能機制。方法選擇對數(shù)生長期乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231，分別加入含濃度為1、10、100 ng/mL的IL-17的培養(yǎng)液進行干預(yù)處理(處理組)，將不含IL-17培養(yǎng)液處理的細胞作為空白對照組。采用CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，Transwell小室實驗檢測細胞穿透能力，Western blot檢測乳腺癌細胞中磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達。結(jié)果100 ng/mL的IL-17作用72 h可明顯抑制MCF-7增殖，10、100 ng/mL IL-17分別作用48 h和72 h可明顯抑制MDA-MB-231增殖。與空白對照組比較，各處理組MCF-7和MDA-MB-231穿膜數(shù)明顯增加，p-ERK、MMP-9表達水平明顯升高(P均＜0.05)，且其表達呈濃度依賴性。結(jié)論IL-17能促進人乳腺癌細胞的侵襲，其機制可能與上調(diào)人乳腺癌細胞中p-ERK和MMP-9表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞:白細胞介素17;乳腺癌;磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶;基質(zhì)金屬蛋白酶-9

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素共同參與的復(fù)雜過程。感染因素在部分乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，約20%的乳腺癌歸因于病毒感染，如EB病毒和人乳頭瘤病毒(HPV)［1，2］。乳腺癌作為一個炎癥相關(guān)性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展可能與炎癥因子IL-17有關(guān)［3］。2013年12月～2014年10月，我們觀察了IL-17對人乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并對細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)表達進行檢測?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231，由徐州醫(yī)學(xué)院腫瘤實驗室保存?zhèn)鞔ＬヅＱ?杭州四季青)，DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，L15培養(yǎng)基(南京凱基)，Metrigel基質(zhì)凝膠(美國BD公司)，Transwell(美國Millipore公司)，IL-17(美國Peprotech公司)，ERK、p-ERK抗體(美國Cell Signaling公司)，MMP-9抗體(武漢博士德)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將MCF-7、MDA-MB-231接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和L15培養(yǎng)基中(加入青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(MDA-MB-231使用無孔培養(yǎng)瓶培養(yǎng))，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細胞增殖能力檢測采用細胞增殖—毒性檢測法。取對數(shù)生長期細胞，加入胰蛋白酶消化、離心，用高糖DMEM培養(yǎng)基將MCF-7調(diào)整為3×104/mL，用L15培養(yǎng)基將MDA-MB-231調(diào)整為4×104/mL，分別接種于96孔板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄培養(yǎng)基，分別加入1、10、100 ng/mL 的IL-7(處理組)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔;空白對照組加入等量培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24、48、72 h。棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液及CCK-8試劑，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，上酶標(biāo)儀于波長450 nm處測量OD值。以上步驟重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3細胞侵襲能力檢測采用Transwell試驗。取MCF-7和MDA-MB-231加入培養(yǎng)基，分別制成2.5×105和3.5×105/mL的單細胞懸液。向Transwell小室的上室中加入無血清培養(yǎng)基(空白對照組)以及1、10、100 ng/mL IL-7處理過的細胞各200 μL，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基400 μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，95%甲醛固定10 min，PBS沖洗，結(jié)晶紫染色，雙蒸水沖洗，用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)表面的細胞，200倍光鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)穿過人工基底膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4ERK、p-ERK、MMP-9檢測采用Western blot法。收集空白對照組和分別含1、10、100 ng/mL濃度IL-17的培養(yǎng)液處理24 h的細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，使用SDS-PAGE蛋白電泳，半干轉(zhuǎn)膜，常規(guī)封閉2 h，一抗(ERK、p-ERK濃度1∶1 000，MMP-9濃度1∶100) 4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)孵育2 h，將聚偏氟乙烯膜放入Washing buffer洗滌，再用ddH2O清洗，加入顯色液，ddH2O終止顯色，觀察、拍照，凝膠圖像分析系統(tǒng)讀取條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以珋x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細胞增殖能力MCF-7各處理組中，100 ng/mL IL-17作用72 h后細胞增殖明顯受到抑制; MDA-MB-231各處理組中，10、100 ng/mL IL-17作用48 h和72 h后細胞增殖明顯受到抑制。見表1。

表1　各組細胞增殖能力比較(n=15，OD值，±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與同濃度24 h比較，#P＜0.05。

組別MCF-7 24 h　48 h　72 h MDA-MB-231 24 h　48 h　72 h空白對照組　0.86±0.16　1.09±0.13　1.31±0.11　0.89±0.04　0.77±0.03　0.92±0.04 IL-17處理組1 ng/mL　0.90±0.99　1.13±0.95#　1.30±0.03#　0.87±0.06　0.77±0.04　0.88±0.04 10 ng/mL　0.93±0.11　1.09±0.10#　1.24±0.11#　0.87±0.05　0.68±0.04* #　0.79±0.04* #100 ng/mL　0.98±0.10　1.08±0.10　0.98±0.07*　0.86±0.05#　0.61±0.03* #　0.73±0.02*#

2.2各組細胞侵襲能力見表2。

表2　各組穿膜細胞數(shù)比較(n=9，±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與1 ng/mL比較，#P＜0.05; 與10 ng/mL比較，ΔP＜0.05。

組別　穿膜細胞數(shù)(個) MCF-7　MDA-MB-231空白對照組7.67±1.53　21.33±1.53 IL-17處理組1 ng/mL　23.67±1.56*　56.67±2.08*10 ng/mL　38.33±2.31* #　102.33±14.57* #100 ng/mL　58.33±4.73* #Δ　139.00±16.70* #Δ

2.3各組ERK、P-ERK、MMP-9表達水平IL-17各處理組和空白對照組比較，ERK蛋白相對表達量無明顯變化，p-ERK、MMP-9蛋白相對表達量增加。提示IL-17可以促進細胞中的p-ERK、MMP-9的表達。見表3。

3　討論

IL-17主要由CD+4T細胞亞群Th17細胞產(chǎn)生，能夠與許多細胞表面的IL-17受體結(jié)合，誘導(dǎo)細胞分泌大量炎癥細胞因子和趨化因子，進而將中性粒細胞招募至炎癥部位，參與中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［4］。IL-17為促炎性細胞因子，與炎癥發(fā)展、免疫應(yīng)答、免疫排斥等多種生物學(xué)活動有關(guān)，許多腫瘤組織如卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等組織中均存在IL-17 mRNA高表達［5～7］。侯倩男等［8］報道，IL-17作用于子宮內(nèi)膜癌細胞，可增加其侵襲力。本研究顯示，IL-17作用于MCF-7、MDA-MB-231后，不同濃度IL-17處理組的穿膜細胞數(shù)均較空白對照組明顯增多，提示IL-17具有增強乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。

MAPK是細胞內(nèi)重要的信號傳遞者，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。IL-17可以激活NF-κB和MAPK通路，通過NF-κB和MAPK發(fā)揮其促炎癥作用［9］。研究表明，ERK調(diào)控異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ERK、p-ERK在乳腺癌細胞中的表達均明顯高于正常乳腺上皮細胞，提示ERK蛋白過度表達和異?；钚钥赡茉谌橄侔┲邪l(fā)揮重要作用。本研究顯示，空白對照組和處理組細胞均有ERK和p-ERK蛋白表達，組間ERK表達無統(tǒng)計學(xué)差異，而處理組p-ERK蛋白表達較空白對照組明顯增加，且隨IL-17濃度增加呈濃度依賴性。

MMPs能夠介導(dǎo)幾乎所有細胞外基質(zhì)有效成分的降解，是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要分子。MMP-9是MMPs家族成員，在頭頸部癌、消化道癌、卵巢癌等組織中表達異常，預(yù)示患者預(yù)后不良［10，11］。IL-17可刺激巨噬細胞、單核細胞分泌TNF-α和IL-1，上調(diào)巨噬細胞分泌MMP-9。高源等［12］報道，乳腺癌組織中MMP-9表達與p-ERK呈正相關(guān)。因此，MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對MMP-9的表達也有一定影響。本研究表明，IL-17可以促進人乳腺癌細胞中MMP-9的表達，且隨IL-17濃度增加呈濃度依賴性。隨著IL-17濃度增高，p-ERK、MMP-9的表達都隨之增加，而總的ERK并沒有明顯增加，提示p-ERK而不是總的ERK異常激活和表達升高與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。表明p-ERK可促進腫瘤細胞MMP-9的表達，從而影響癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移。

腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是非常復(fù)雜的過程，是多因素多環(huán)節(jié)形成的，雖然本研究顯示IL-17能夠增強p-ERK和MMP-9的表達，促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但其具體的調(diào)節(jié)機制仍需進一步研究證實。

表3　各組ERK、P-ERK、MMP-9表達水平比較(n=5，±s)

注:處理組與空白對照組比較，*P＜0.05;處理組間比較，#P＜0.05。

組別MCF-7 p-ERK　ERK　MMP-9 MDA-MB-231 p-ERK　ERK　MMP-9空白對照組　0.39±0.03　1.06±0.07　0.29±0.01　0.49±0.02　1.32±0.14　0.75±0.02 IL-17處理組1 ng/mL　0.57±0.03* #　1.08±0.10　0.34±0.00* #　0.62±0.04* #　1.32±0.18　0.80±0.02* #10 ng/mL　0.73±0.02* #　1.15±0.07　0.36±0.01* #　0.76±0.06* #　1.30±0.12　1.04±0.04* #100 ng/mL　0.88±0.14* #　1.15±0.09　0.57±0.02* #　0.88±0.10* #　1.28±0.10　1.13±0.02*#

參考文獻:

［1］Lin JH，Tsai CH，Chu JS，et al.Dysregulation of HER2/HER3 signaling axis in Epstein-Barr virus-infected breast carcinoma cells ［J］.Virol，2007，81(11) : 5705-5713.

［2］劉靜，尚凡晶，劉建生，等.人乳頭瘤病毒感染與乳腺癌的關(guān)系及與P16蛋白表達的相關(guān)性研究［J］.中國藥物與臨床，2011，2(3) : 147-150.

［3］馬志萍，李鋒，張文杰.IL-17在乳腺癌中的表達及其意義［J］.石河子大學(xué)學(xué)報，2012，30(5) : 615-620.

［4］Gaffen SL.Structure and signaling in the IL-17 receptor family ［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(8) : 556-567.

［5］Su X，Ye J，Hsueh EC，et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells［J］.J Immunol，2010，184(3) : 1630-1641.

［6］Zhu X，Mulcahy LA，Mohammed RA，et al.IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages: IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines［J］.Breast Cancer Res，2008，10(6) : R95.

［7］Kryczek I，Banerjee M，Cheng P，et al.Phenotype，distribution，generation，and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments［J］.Blood，2009，114(6) : 1141-1149.

［8］侯倩男，賴婷，郄明蓉.白細胞介素-17對子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC-1-B基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-9基因表達及腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響［J］.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2011，7(2) : 105-108.

［9］Shen F，Gaffen SL.Structure-function relationships in the IL-17 receptor: implications for signal transduction and therapy［J］.Gytokine，2008，41(2) : 92-104.

［10］郭云泉，趙峰，梁莉萍，等.基質(zhì)金屬蛋白酶-9在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，30(5) : 498.

［11］張慧芹，劉閣玲.基質(zhì)金屬蛋白酶9在甲狀腺癌中的表達及臨床意義［J］.醫(yī)學(xué)理論與實踐，2005，18(4) : 390.

［12］高源，景麗，泰璟，等.MMP-9、ERK2及nm23與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2011，33(1) : 8-11.

(收稿日期:2014-12-27)

文章編號:1002-266X(2015) 18-0060-03

文獻標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.022