范廣建 張堅(jiān)

柴胡桂枝湯為小柴胡湯和桂枝湯的合方，主要用于太陽(yáng)少陽(yáng)合病引起的發(fā)熱惡寒、肢體疼痛等癥［1］。柴胡桂枝湯在現(xiàn)代臨床應(yīng)用也十分廣泛，主要用于治療 發(fā) 熱［2-9］、循 環(huán) 系 統(tǒng) 病 癥［10-13］、消 化 系 統(tǒng) 病癥［14-20］、內(nèi)分泌系統(tǒng)病癥［21］、植物神經(jīng)功能紊亂［22］及婦科疾?。?3］等。由于傳統(tǒng)湯劑煎煮麻煩、服用劑量大、不方便攜帶及口味難以下咽，而中藥配方顆粒具有劑量準(zhǔn)確、即沖即服和貯存攜帶方便等特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)中藥飲片調(diào)配稱量不夠準(zhǔn)確、服用劑量不易掌握、易污染等缺點(diǎn)［24］。故而在柴胡桂枝湯的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化開發(fā)了柴胡桂枝顆粒，但現(xiàn)有柴胡桂枝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)黃芩中的黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定，但對(duì)君藥柴胡和桂枝的指標(biāo)性成分的含量測(cè)定尚未見報(bào)道，作者采用HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定君藥桂枝中的桂皮酸和桂皮醛的含量的方法，由此為柴胡桂枝顆粒提供了一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地質(zhì)量控制手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀及工作站(美國(guó)Agilent公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);AS系列超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 柴胡桂枝顆粒(由本院研發(fā)中心提供，批號(hào)為 091401，091403，091404，091405)，桂皮酸、桂皮醛對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)，乙腈、冰醋酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為蒸餾水，甲醇為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品貯備液的制備:取桂皮酸對(duì)照品12.65 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1毫升中含桂皮酸0.25 mg)。精密稱取桂皮醛對(duì)照品10.60 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1毫升中含桂皮酸1.06 mg)。

2.1.2 供試品溶液的制備:取本品適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50.0 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率400 W，頻率25 kHz)30 min，放至室溫后，再稱定質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液1.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備:按照柴胡桂枝顆粒的處方及制備工藝，制備不含桂枝的陰性樣品，按2.1.2項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈-1.0%醋酸水溶液(30∶70)，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，流1.0 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl，柱溫:35℃。在此條件下，理論塔板數(shù)(N)按桂皮酸峰計(jì)算為5 000，按桂皮醛峰計(jì)算為3 900。桂皮酸和桂皮醛色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5。結(jié)果顯示，在上述波長(zhǎng)下樣品色譜峰分離度很好，并且陰性供試品溶液對(duì)桂皮酸和桂皮醛的測(cè)定無(wú)干擾。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定:以流動(dòng)相為空白對(duì)照，在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)桂皮酸和桂皮醛對(duì)照品稀釋液進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，桂皮酸和桂皮醛均在290 nm處有最大吸收峰，故以290 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 線性關(guān)系考察:精密吸取桂皮酸對(duì)照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml分別置 50 ml量瓶中，再依次分別精密加入桂皮醛對(duì)照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml于相應(yīng)的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取20 μl進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到桂皮酸的回歸方程為Y=147.23X+4.3834，相關(guān)系數(shù)r=0.9997，桂皮酸的回歸方程為Y=103.75X+11.1370，相關(guān)系數(shù)r=0.9992，結(jié)果表明桂皮酸在 2.024～12.144 μg/ml，桂皮醛在 8.480 ～ 50.880 μg/ml與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 專屬性考察:分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照樣品溶液各20 μl進(jìn)樣，分別記錄其色譜圖。在“2.2”色譜條件下，供試品中桂皮酸和桂皮醛的色譜峰與對(duì)照品中這兩種成分的色譜峰保留時(shí)間均一致，桂皮酸和桂皮醛與樣品中其他成分分離度均大于1.5，且陰性樣品溶液中在相應(yīng)的位置沒有色譜峰干擾，由此表明本方法的專屬性良好。見圖1～3。

圖2 供試品溶液色譜圖1:桂皮醛;2:桂皮酸

圖3 陰性樣品溶液色譜圖

2.3.4 精密度試驗(yàn):取含有桂皮醛6.072 μg/ml和桂皮酸25.440 μg/ml的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，分別記錄其峰面積，測(cè)得桂皮醛的 RSD=1.19%(n=5)，桂皮酸的 RSD=1.05%(n=5)。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)091403)樣品溶液按2.2項(xiàng)下色譜條件，1 d內(nèi)平行操作6份，測(cè)得桂皮酸的含量 RSD=1.06%(n=6);桂皮醛的含量RSD=0.95%(n=6)，結(jié)果顯示方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為4 g/L(批號(hào)091403)樣品溶液按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別于1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，共測(cè)6次，求得桂皮酸的峰面積RSD=1.19%(n=6)，桂皮醛的峰面積 RSD=1.30%(n=6)，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 檢測(cè)限和定量限:取含桂皮酸2.024 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液和桂皮醛8.480 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，分別逐級(jí)稀釋，以信噪比(S/N)3確定檢測(cè)限，以信噪比(S/N)10確定定量限，桂皮酸和桂皮醛的定量限分別為0.025，0.1 μg/ml;桂皮酸和桂皮醛的定量限分別為0.15，0.2 μg/ml。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn):精密稱取已測(cè)定含量的柴胡桂枝顆粒(批號(hào)091403)樣品6份，每份0.25 g，分別精密加入濃度為0.253 mg/ml桂皮醛對(duì)照品貯備液及濃度為1.060 mg/ml桂皮酸對(duì)照品貯備液各1 ml，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，計(jì)算平均回收率，測(cè)得桂皮酸的平均回收率為99.73%，RSD=1.83%(n=6);桂皮醛的平均回收率為100.09%，RSD=1.39%(n=6)。見表1。

表1 桂皮酸和桂皮醛的回收率

2.4 樣品的測(cè)定 取4個(gè)不同批號(hào)的柴胡桂枝顆粒，按2.1.2項(xiàng)下處理，依照2.2項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行含量測(cè)定，每份樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算平均值。見表2。

表2 桂皮酸和桂皮醛的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)中采用的色譜條件是參考《中國(guó)藥典》2010版“桂枝”含量測(cè)定項(xiàng)下的流動(dòng)相為:乙腈:0.1%冰醋酸(33∶67)［25］，但是抑制拖尾效果不是很明顯，而且桂皮酸和桂皮醛的分離度不理想，故而在此基礎(chǔ)上稍作了調(diào)整，流動(dòng)相定為:乙腈:1.0%冰醋酸(30∶70)。

本實(shí)驗(yàn)考察了超聲提取法和回流提取法對(duì)樣品中桂皮酸和桂皮醛含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取方式得到的桂皮酸含量相差不大，但是桂皮醛的含量差異很大，超聲提取法得到的桂皮醛含量較高，所以確定提取方式為超聲提取。在對(duì)樣品中桂皮酸和桂皮醛的提取條件的考察中分別對(duì)甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇幾種提取溶劑進(jìn)行了分析比較，結(jié)果顯示甲醇提取的桂皮酸含量最高，70%甲醇提取的桂皮醛含量最高，但是甲醇和70%甲醇提取的桂皮醛的含量相差不大，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

提取溶劑的體積也較大程度地影響提取效果，因此對(duì)提取溶劑的體積進(jìn)行了考察，分別采用10、25、40 ml的甲醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果顯示25 ml和40 ml甲醇溶液提取出的桂皮酸和桂皮醛的含量相差不大，因此選擇25 ml作為提取溶液的體積。及此外又對(duì)超聲提取的時(shí)間進(jìn)行了考察，比較了提取20、30、40 min桂皮酸和桂皮醛的含量，結(jié)果顯示提取30 min和40 min兩種成分含量沒有太大區(qū)別，所以提取時(shí)間定為30 min。

采用HPLC法對(duì)柴胡桂枝顆粒中桂皮酸和桂皮醛的含量進(jìn)行測(cè)定，方法學(xué)研究結(jié)果表明此方法簡(jiǎn)單可行，準(zhǔn)確度和靈敏度高，重復(fù)性好等指標(biāo)均符合要求。

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