付深振 戴聞韜， 費 燁 彭江南 閆興麗 高增平

(1 北京中醫(yī)藥大學，北京，100102； 2 University of Texas Health Science Center at San Antonio，Texas 78229，USA)

圓葉大黃的化學成分及細胞毒活性初步研究

付深振1戴聞韜1，2費 燁1彭江南2閆興麗1高增平1

(1 北京中醫(yī)藥大學，北京，100102； 2 University of Texas Health Science Center at San Antonio，Texas 78229，USA)

目的：研究圓葉大黃(RheumTataricumL.F.)的化學成分及主要成分的細胞毒活性。方法：采用silica gel、Sephadex LH-20、HPLC等色譜法對圓葉大黃80﹪乙醇提取物進行分離純化，通過LC/MS，1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR和薄層色譜檢識等技術，結合相關文獻確定化合物的結構；運用SRB法對分離得到的主要成分進行Hela細胞的細胞毒活性篩選。結果：從圓葉大黃中分離鑒定出11個化合物，分別為大黃酚(1)，大黃素(2)，大黃素甲醚(3)，蘆薈大黃素(4)，Rheosmin(5)，1，3，8-trihydroxyanthraquinone(6)，β-谷甾醇(7)，胡蘿卜苷(8)，大黃素-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside(9)，大黃素甲醚-8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside(10)，大黃酚-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside(11)；對化合物4、5、6、9、10、11進行了細胞毒活性篩選，其中化合物4、6、9、10、11均對Hela細胞具有細胞毒活性，化合物5對Hela細胞無細胞毒活性。結論：8個化合物(化合物4-11)均為首次從該植物中分離得到，5個化合物對Hela細胞有細胞毒活性，且化合物5，6，9，10，11均為首次對Hela細胞進行細胞毒活性篩選。

圓葉大黃；化學成分；細胞毒活性

圓葉大黃(RheumTataricumL.F.)為蓼科(Polygonaceae)大黃屬多年生中型草本植物，別名韃靼大黃，在我國主要分布于新疆西部地區(qū)，另在阿富汗、俄羅斯、哈薩克斯坦也有分布[1]，在俄羅斯當?shù)乜勺鍪卟耸秤肹2]，在我國尚未有食用和藥用價值的相關報道。但是在西藏市場上發(fā)現(xiàn)其作為藏藥塔黃有銷售。塔黃為蓼科大黃屬高山大黃[3-5](RheumnobileHook.f.et Thoms)的根和根莖，產于西藏喜馬拉雅山麓及云南西北部，在藏醫(yī)中用于治療黃水[3，6]、惡性腹水、腎水腫、“培根”病[7-8]等，在印度、錫金等國也被廣泛作為藥用[9]。對于究竟圓葉大黃能否代替塔黃入藥尚未見相關研究報道，因此本課題組在研究藏藥塔黃的基礎上初步探索了圓葉大黃的化學成分和其主成分的細胞毒活性，為全面對比藏藥塔黃與圓葉大黃的化學成分和藥理活性，確保藏藥塔黃的用藥安全和有效奠定基礎。

1 藥材、儀器及試藥

藥材：購自西藏拉薩，經北京中醫(yī)藥大學魏勝利副教授鑒定為蓼科大黃屬圓葉大黃RheumTataricumL.F.的根莖。儀器：Bruker-Avance VNS-600和Bruker AVANCE-III-500 mHz型核磁共振儀，Waters高效液相色譜儀，薄層色譜硅膠及柱色譜硅膠均為青島海洋化工廠生產，AB-8型大孔樹脂為天津南開大學化工廠生產，Sanyo CO2Incubator，Molecular Devices Spectra max。試劑：所用試劑均為分析純。Hela細胞購自于American Type Culture collection，Basal Medium eagle，trypsin購自于Sigma Life Science。

2 提取和分離

藥材粗粉10 kg，80%乙醇回流提取三次，2 h/次。減壓回收溶劑得到浸膏，加水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到五個部位。石油醚部位，經反復硅膠柱色譜分離及重結晶，得到化合物1(891.4 mg)，化合物2(16.5 mg)，化合物3(86.6 mg)，化合物4(41 mg)，化合物5(5 mg)。乙酸乙酯部位，經反復硅膠柱色譜，HPLC以及重結晶，得到化合物6(25 mg)，化合物7(10 mg)，化合物8(84.4 mg)，化合物9(30 mg)，化合物10(20 mg)，化合物11(5 mg)。

3 結構鑒定

化合物1，化合物2，化合物3，化合物7，化合物8經與對照品進行TLC對比(三個溶劑展開系統(tǒng))，分別為大黃酚，大黃素，大黃素甲醚，β-谷甾醇和胡蘿卜苷，化合物5經1H-NMR(600 mHz，DMSO)確定其結構為Rheosmin?；衔?：黃色結晶。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.261(1H，s，H-2)，7.651(1H，s，H-4)，7.684(1H，d，J=7.2 Hz，H-5)，7.778(1H，t，J=7.8Hz，H-6)，7.345(1H，d，J=8.4 Hz，H-7)。13C-NMR(600 MHz，DMSO)δ：161(C-1)，120.5(C-2)，153.7(C-3)，117.1(C-4)，119.2(C-5)，137.4(C-6)，123.7(C-7)，161(C-8)，191.4(C-9)，181(C-10)，114.5(C-11)，135.1(C-12)，114.4(C-13)，136.5(C-14)。以上數(shù)據與蘆薈大黃素文獻報道的數(shù)據一致[10-11]，故鑒定該化合物為蘆薈大黃素?；衔?：黃色粉末。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.748(1H，s，H-2)，8.134(1H，s，H-4)，7.737(1H，d，J=6.6 Hz，H-5)，7.827(1H，t，J=6.6 Hz，H-6)，7.411(1H，d，J=7.2 Hz，H-7)。13C-NMR(600 MHz，DMSO)δ：161.6(C-1)，124.4(C-2)，166.2(C-3)，119.4(C-4)，119.9(C-5)，138.1(C-6)，125.2(C-7)，161.8(C-8)，191.9(C-9)，181.8(C-10)，111.8(C-11)，133.8(C-12)，119.1(C-13)，139.7(C-14)。以上數(shù)據與1，3，8-trihydroxyanthraquinone的文獻報道一致[12]，故鑒定該化合物為1，3，8-trihydroxyanthraquinone?；衔?：黃色粉末。ESI-MS：m/z 474[M]+，497[M+Na]+；1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：6.949(1H，s，H-2)，7.289(1H，s，H-4)，7.445(1H，s，H-5)，7.147(1H，s，H-7)，5.218(1H，d，H-1')，3.450(1H，dd，J=5.4，7.2Hz，H-2')，3.29-3.376(H-3'，H-4' overlapped with H2O)，3.686(1H，J=1.2，7.2，10.2 Hz，H-5')，4.100(1H，J=6.0，10.2Hz，H-6')，4.309(1H，J=7.2，10.2Hz，H-6')。以上數(shù)據與emodin-8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside的文獻報道一致[13]，故鑒定該化合物為emodin-8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside?；衔?0：黃色粉末。ESI-MS：m/z 488[M]+，511[M+Na]+；1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.151(1H，s，H-2)，7.392(1H，s，H-4)，7.463(1H，s，H-5)，7.126(1H，s，H-7)，5.219(1H，d，J=6.6 Hz，H-1')，3.482(1H，dd，J=4.3，6.6 Hz，H-2')，3.300(1H，t，J=4.3 Hz，H-3')，3.243(H-4'，overlapped with water)，3.752(1H，ddd，J=2.6，6.2，9.3 Hz，H-5')，4.056(1H，dd，J=6.2，9.3 Hz，H-6')，4.348(1H，dd，J=2.6，9.3 Hz，H-6')。以上數(shù)據與physcion-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside的文獻報道一致[14]，故鑒定該化合物為physcion-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside 。化合物11：黃色粉末。ESI-MS：m/z 458[M]+，481[M+Na]+；1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：2.007(3H，s，-OAc)，2.48(3H，s，Me)，7.497(1H，s，H-2)，7.725(1H，s，H-4)，7.633(1H，d，J=0.6 Hz，H-5)，7.725(1H，br.s，H-6)，7.317(1H，d，J=6.0 Hz，H-7)，5.219(1H，d，J=6.6 Hz，H-1')，3.489(1H，dd，J=4.2，6.6 Hz，H-2')，3.357(1H，t，J=4.2 Hz，H-3')，3.250(H-4'，overlapped with H2O)，3.723(1H，ddd，J=2.4，6.0，9.0 Hz，H-5')，4.050(1H，dd，J=6.0，9.0Hz，H-6')，4.362(1H，dd，J=2.4，9.0 Hz，H-6')，12.940(s，OH-8)。以上數(shù)據與，chrysophanol-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside的文獻報道一致[13]，故鑒定該化合物為chrysophanol-1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside。

4 細胞毒活性篩選

4.1 試驗方法 Hela細胞BME(Basal Medium Eagle)培養(yǎng)基，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中24 h后，分別加入濃度為20 μg/mL的化合物4，化合物5，化合物6，化合物9，化合物10，化合物11，DMSO為對照。給藥后置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中48 h，然后采用SRB法[15-16]進行細胞毒活性篩選及分析。

4.2 實驗結果 經SRB法分析，結果化合物5對Hela細胞沒有細胞毒活性，另外5個化合物對Hela細胞有不同程度的細胞毒活性。其中活性最強的是化合物4，細胞數(shù)為對照(DMSO)的20.6%，活性最弱的為化合物9，細胞數(shù)為對照的90.1%，化合物6，10和11的細胞數(shù)分別為對照的35.5%，52.57%和53.0%。

5 總結與討論

通過對圓葉大黃的化學成分進行初步研究，共得到11個化合物，其中8個化合物(化合物4-11)為首次從該植物中分離得到，進而為圓葉大黃與塔黃的化學成分對比提供了部分依據；對其中的六個化合物進行針對Hela細胞的細胞毒活性的初步篩選，SRB分析結果為其中化合物4、6、9、10、11對Hela細胞有不同程度的細胞毒活性，化合物5對Hela細胞無細胞毒活性，這為圓葉大黃與塔黃的藥理活性對比提供依據；五個對Hela細胞有細胞毒活性的化合物均為蒽醌或其苷類，這將為進一步的研究蒽醌及其苷類化合物的細胞毒活性奠定基礎?？傊ㄟ^對圓葉大黃化學成分及部分成分的細胞毒活性研究，為其進一步的與塔黃進行比較研究奠定基礎，從而確定圓葉大黃是否可以代替藏藥塔黃使用，以確保藏藥塔黃的市場規(guī)范和用藥安全。

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(2014-03-09收稿 責任編輯：徐穎)

Primary Study on Chemical Constituents of Rheum Tataricum L.F.and Their Cytotoxic Activity

Fu Shenzhen1，Dai Wentao1，2，F(xiàn)ei Ye1，Peng Jiangnan2，Yan Xingli1，Gao Zengping1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China; 2UniversityofTexasHealthScienceCenteratSanAntonio，Texas78229，USA)

Objective： To investigate the chemical constituents of the Rheum Tataricum and evaluate some of the compounds for cytotoxic activity against Hela cell.Methods:Silica gel，Sephadex LH-20 column，chromatography High Performance Liquid Chromatography methods were used to do isolation.The structures of isolates were confirmed by spectral (LC/MS，1H-NMR，13C-NMR，2DNMR，thin-layer chromatograph) analysis and by comparison with the literature reports; Cytotoxic activities were determined by the SRB method.Results:Eleven compounds were gained and they were chrysophanol (1)，emodin(2)，Physcion (3)，Aloe-emodin (4)，Rheosmin (5)，1，3，8-trihydroxyanthraquinone (6)， Sitosterol (7)， Daucosterol (8)，emodin8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside (9)，physcion1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside (10)，chrysophanol1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside (11); six compounds were evaluated for cytotoxic activities，five of them showed cytotoxic activity against Hela cell，and they were Aloe-emodin，1，3，8-trihydroxyanthraquinone，emodin8-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside，physcion1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside，chrysophanol1-O-β(6'-O-acety)glucopyranoside，rheosmin has no activity.Conclusion:Eight (compound 4-11)of them are isolated from Rheum nobile for the first time; five of the compounds show cytotoxic activities，compound5，6，9，10，11are evaluated for cytotoxic activities against Hela cell for the first time.

Rheum Tataricum; Chemical consitutents; Cytotoxic activity

R28

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.029